吳慶華，王 參，蘇國(guó)玲，麻希洋，梅世月，孔祥東，史惠蓉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心 鄭州 450052

多囊腎病(polycystic kidney disease，PKD)是一種臨床表型和遺傳異質(zhì)性較高的疾病，分為常染色體顯性遺傳PKD(autosomal dominant PKD,ADPKD)和常染色體隱性遺傳PKD(autosomal recessive PKD,ARPKD)。最初ADPKD被認(rèn)為只在成人期發(fā)病，故又被稱為成人型PKD，而絕大多數(shù)ARPKD只在嬰兒期發(fā)病，故臨床上也稱為嬰兒型PKD，目前有報(bào)道[1-2]表明ADPKD也可在兒童期甚至嬰兒期發(fā)病，而ARPKD可在出生后或更晚時(shí)期發(fā)病。ADPKD發(fā)病率估計(jì)為1/1 000～1/400[3]，半數(shù)患者在70歲前進(jìn)展為終末期腎衰竭，85%的ADPKD病例是由于16p13.3～13.12上的PKD1基因突變致病，15%為4q21～23上的PKD2基因突變引起。ARPKD在活產(chǎn)兒發(fā)病率約為1/20 000，位于6號(hào)染色體p12.3～12.2的PKHD1是其主要致病基因[4]。因患者臨床癥狀及發(fā)病時(shí)間變異大，PKD的確診需明確基因診斷，大多數(shù)患者經(jīng)高通量測(cè)序技術(shù)而被診斷。本研究家系中，先證者妻子曾有兩次多囊腎胎兒孕育史。為避免先證者家庭再次孕育患兒，我們應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)先證者及其妻子行遺傳性腎病相關(guān)基因篩查，對(duì)該家系相關(guān)成員行基因分析，以明確病因，為再次妊娠提供指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象先證者及其配偶妊娠兩次，均于孕中期因胎兒超聲提示多囊腎，羊水過少而終止妊娠且未留取胎兒組織標(biāo)本，再次妊娠前來我院行遺傳咨詢了解生育風(fēng)險(xiǎn)。該夫婦無近親結(jié)婚史、無明確的孕期藥物或不良因素接觸史。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：KS-2018-KY-36)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2家系調(diào)查先證者，男，26歲，無特殊臨床表現(xiàn)，在我院經(jīng)彩超及CT檢查提示雙側(cè)腎臟大小形態(tài)正常伴多發(fā)囊腫，尿常規(guī)提示尿蛋白1+。先證者妻子腹部彩超、尿常規(guī)及生化檢查均未見異常。先證者母親，53歲，彩超檢查提示雙腎大小形態(tài)正常伴多發(fā)囊腫，無與多囊腎相關(guān)的臨床表現(xiàn)及其他不適。先證者父親腹部超聲未見異常。先證者姐姐，29歲，彩超提示雙腎形態(tài)欠規(guī)整，右腎可見一大小約7 mm×5 mm的囊腫。先證者弟弟，23歲，于2 a前曾因“腹痛，腹部包塊”來我院就診，血壓高至159/101 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，超聲提示雙腎形態(tài)失常并多發(fā)囊腫；泌尿系計(jì)算機(jī)體層攝影尿路造影檢查發(fā)現(xiàn)腎形態(tài)失常，雙腎多發(fā)囊腫，左腎為著，雙腎多發(fā)結(jié)石；腎動(dòng)態(tài)顯像和腎小球?yàn)V過率檢查提示腎小球?yàn)V過率下降，左右側(cè)分別為33.58及49.48 mL/min；尿常規(guī)示白細(xì)胞3+，蛋白2+；腎功能示尿素9.88 mmol/L，肌酐133 μmol/L；心臟超聲提示左室壁均勻性增厚(高血壓性心臟病樣改變)。先證者岳父母肝腎超聲未見異常。該家系遺傳圖譜見圖1。

1.3遺傳性腎病基因篩查

1.3.1 DNA提取 采集該家庭先證者及其配偶，先證者母親、姐姐及弟弟的外周血2 mL，采用北京天根公司的DNA提取試劑盒提取全基因組DNA，4 ℃保存。

1.3.2 高通量測(cè)序 采用靶向基因捕獲技術(shù)結(jié)合Illumina二代測(cè)序平臺(tái)，對(duì)先證者及其配偶行63個(gè)遺傳性腎病相關(guān)致病基因(腎臟和泌尿系發(fā)育異常、腎小球疾病、腎小管疾病、纖毛功能異常、遺傳代謝病相關(guān)的基因)的高通量測(cè)序。

1.3.3 PCR及Sanger測(cè)序 高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)PKD1基因?yàn)榭梢芍虏⊥蛔兾稽c(diǎn)，應(yīng)用PCR擴(kuò)增先證者及其母親、姐姐及弟弟全基因組DNA，并用Sanger測(cè)序進(jìn)行一代驗(yàn)證，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列:5’-CAAGAGGCTCAAGAAACTGCCCG-3’，下游引物序列: 5’-GGCCACCAGT GAGAAGTACAGG-3’，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用ABIBigDye 3.1測(cè)序試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，用ABI Sequencing Analysis 5.1.1軟件將測(cè)序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證基因突變位點(diǎn)。

□:正常男性；■：患病男性；○：正常女性；●：患病女性；：先證者；：終止妊娠的患胎

圖1該家系遺傳圖譜

2 結(jié)果

2.1高通量測(cè)序結(jié)果先證者的PKHD1基因各外顯子序列可檢測(cè)到多個(gè)已知多態(tài)性變異，未檢測(cè)到已知或者疑似致病變異；其PKD1基因檢測(cè)到1個(gè)疑似致病突變：c.10678G>A(p.G3560R)雜合突變，同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)多態(tài)性變異，未見其他明確與該疾病相關(guān)的基因突變；先證者配偶未檢測(cè)到可疑突變。

2.2PCR和Sanger測(cè)序結(jié)果對(duì)先證者及其母親、姐姐及弟弟行PKD1基因c.10678G>A突變篩查，結(jié)果確定先證者及其母親和姐姐攜帶PKD1基因c.10678G>A雜合突變；先證者弟弟未檢測(cè)到該突變，見圖2。

上：箭頭示先證者PKD1基因c.10678G>A(p.G3560R)雜合突變；下：先證者弟弟該位點(diǎn)未見突變

圖2先證者及其弟PKD1基因c.10678G>A的突變篩查結(jié)果

3 討論

絕大多數(shù)ARPKD患者在胎兒期即被診斷，常表現(xiàn)為雙側(cè)顯著增大的腎臟及羊水過少，由于腎臟體積過大壓迫胸腹腔而導(dǎo)致患兒肺臟發(fā)育異常，高達(dá)30%～50%的患兒在出生后不久即死于呼吸道功能不全，而腎功能衰竭很少是新生兒的死亡原因[5]。存活者有腎臟功能受損且通常伴腎性高血壓和門靜脈高壓，可導(dǎo)致新生兒期及兒童期死亡。PKHD1基因突變是導(dǎo)致ARPKD的主要病因，有研究表明DZIPIL可能是另一個(gè)與其發(fā)病相關(guān)的基因[6-8]。

ADPKD多在出生后人群中表現(xiàn)為腎臟囊腫，增大的腎臟體積與腎功能受損程度呈正相關(guān)[9-10]，患者腎臟功能受損表現(xiàn)為尿濃縮功能下降，隨后出現(xiàn)腎功能不全等，還可有因感染或囊內(nèi)出血導(dǎo)致的急性或慢性疼痛、高血壓、血尿、尿路感染、腎結(jié)石等以及腎臟外表現(xiàn)如肝囊腫等[11-12]。患者疾病進(jìn)程變異大，絕大多數(shù)患者起病于20～40歲，僅2%～5%在兒童期確診[6]，少數(shù)患者在胎兒期發(fā)病，已有相關(guān)文獻(xiàn)[13]報(bào)道早發(fā)型ADPKD(兒童期甚至胎兒期發(fā)病)主要由PKD1基因突變所致。ADPKD具有高度臨床異質(zhì)性，即使同一家庭中攜帶相同基因突變者臨床表現(xiàn)也可以存在很大差別[14]。盡管ARPKD不如ADPKD常見，遺傳及臨床表型異質(zhì)性不如ADPKD高，但有少數(shù)ARPKD患者可存活至兒童期甚至成人期，極少數(shù)患者可存活至老年才發(fā)病，故少數(shù)情況下ADPKD較難與ARPKD相鑒別[15-18]。

本研究家系中，先證者雙腎多發(fā)囊腫，該夫婦有兩次多囊腎胎兒孕育史且均未留取組織標(biāo)本，來我院進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢。我們首先應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)先證者及其妻子行包括PKD在內(nèi)的63種遺傳性腎病基因篩查，結(jié)果提示先證者PKD1基因1個(gè)疑似致病突變：c.10678G>A(p.G3560R)雜合突變，先證者妻子未檢測(cè)到該突變。先證者母親及姐姐均攜帶有PKD1基因c.10678G>A突變，而經(jīng)影像學(xué)檢查明確診斷為PDK且伴有典型ADPKD臨床表現(xiàn)的先證者弟弟未檢測(cè)到該突變。有相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道認(rèn)為該突變可能為不致病突變或多態(tài)位點(diǎn)。結(jié)合本研究家系中各成員臨床表現(xiàn)和已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，認(rèn)為該突變位點(diǎn)致病可能性小，不是導(dǎo)致該家系胎兒多囊腎的原因。先證者弟弟為臨床明確診斷的成人型PKD患者，該患者拒絕行全面的遺傳性腎病高通量測(cè)序基因篩查，目前該患者病因尚不明確。

通過現(xiàn)有影像學(xué)及高通量測(cè)序篩查技術(shù)，大部分PKD患者都可以明確病因，但仍有少部分患者不能確定遺傳學(xué)病因[6]。本研究家系中同時(shí)有兩次多囊腎胎兒孕育史、成人型PKD患者史及多位家族成員腎臟多發(fā)囊腫表現(xiàn)，鑒于ADPKD和ARPKD的臨床異質(zhì)性，考慮這兩類遺傳性腎病在該家系同時(shí)存在的可能性，建議該家系相關(guān)成員定期行腎臟超聲和腎功能檢查，同時(shí)先證者妻子在孕期詳細(xì)行胎兒腎臟超聲檢查以降低該家庭的生育風(fēng)險(xiǎn)。