石 潔，鄭丹薇，朱巖昆，馬曉光，王少華，李 輝，張國龍

河南省疾病預(yù)防控制中心 鄭州 450016

結(jié)核病是嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題，尤其是發(fā)展中國家。盡管世界衛(wèi)生組織在2017年提出了“終止結(jié)核病”的目標(biāo)，但我國每年新發(fā)結(jié)核病約90萬例，是全球第三大高負(fù)擔(dān)國家，特別是耐多藥結(jié)核病疫情較重[1]。河南省作為中國人口最多的省份，結(jié)核和耐多藥結(jié)核患者數(shù)均多于其他省份，近年來平均發(fā)病率為81/10萬[2]。目前針對河南省結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)的研究較少，亟需對河南菌株進(jìn)行分型分析。

制定一套合適的分型方法對于結(jié)核病的防控有重要的意義，可調(diào)查結(jié)核病的傳播模式，追蹤結(jié)核病的傳播，監(jiān)測可疑的結(jié)核病暴發(fā)[3]。間隔區(qū)寡核苷酸分型(spoligotyping)是通過檢測結(jié)核分枝桿菌基因組中43個同向重復(fù)序列是否缺失進(jìn)行分型的方法，是鑒定北京家族基因型的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。分枝桿菌散在重復(fù)單元-數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(mycobacterium interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat，MIRU-VNTR)分型是另一種結(jié)核分枝桿菌分型方法，其根據(jù)不同位點(diǎn)散在重復(fù)單位數(shù)目的不同進(jìn)行分型[3,5]。這兩種方法均操作簡單，結(jié)果可數(shù)字化，重復(fù)性較好，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益，二者結(jié)合后對結(jié)核分枝桿菌具有較高的分辨力。以往研究[6-7]表明，除了傳統(tǒng)24位點(diǎn)外，ETRF和Mtub38這兩個位點(diǎn)對于我國結(jié)核分枝桿菌的分型有較高的分辨力。本研究使用Spoligotyping和26位點(diǎn)(標(biāo)準(zhǔn)24位點(diǎn)和ETRF、Mtub38)MIRU-VNTR方法評價了河南省結(jié)核分枝桿菌的基因多態(tài)性，并將26位點(diǎn)的檢驗效能與標(biāo)準(zhǔn)24位點(diǎn)、15位點(diǎn)和12位點(diǎn)相比較。

1 材料與方法

1.1菌株來源和試劑對本實(shí)驗室凍存的2015年間來自河南不同地區(qū)肺結(jié)核病患者的臨床分離株進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，排除培養(yǎng)失敗菌株，共計納入668株。結(jié)核病患者的納入標(biāo)準(zhǔn)參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南》。以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為對照菌株。使用康為世紀(jì)的2×Taq Plus MasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。商品化雜交膜購自Isogen Bioscience 生物公司(荷蘭)。

1.2基因組DNA的提取刮取一環(huán)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物重懸于300 μL TE緩沖液中，于85 ℃滅活，沸水浴加熱5 min后，12 000×g離心5 min，取上清備用。

1.3Spoligotyping使用商品化的雜交膜對所提取的菌株基因組DNA進(jìn)行Spoligotyping[8]。使用生物素標(biāo)記的引物Dra(5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’)和Drb(5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’)擴(kuò)增結(jié)核桿菌的同向重復(fù)區(qū)域，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與共價結(jié)合有43個寡核苷酸探針的膜雜交。雜交膜用含有0.5% SDS的SSPE緩沖液洗滌后，與過氧化物酶反應(yīng)30 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液檢測并判讀結(jié)果。分型結(jié)果以八進(jìn)制編碼顯示，并與國際Spoligotyping數(shù)據(jù)庫SITVIT2進(jìn)行比對，確定樣本菌的家族類型和Spoligotype國際編碼(Spoligotype international type，SIT)[9]。為描述基因簇間的遺傳關(guān)聯(lián)，應(yīng)用Bionumeric6.6構(gòu)建最小生成樹，其中每個結(jié)點(diǎn)代表一個單獨(dú)的基因型，每個結(jié)點(diǎn)大小取決于每種基因型中的菌株數(shù)目[10]。

1.4MIRU-VNTR分型為進(jìn)一步確定菌株的遺傳學(xué)關(guān)系，我們采用26位點(diǎn)MIRU-VNTR分型，包括傳統(tǒng)24位點(diǎn)和其他2個位點(diǎn)(ETRF和Mtub38)。參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計引物,對每個位點(diǎn)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)每個位點(diǎn)的側(cè)翼和重復(fù)序列的長度計算串聯(lián)序列的重復(fù)數(shù)。以H37Rv作為對照菌株，以無菌水的擴(kuò)增產(chǎn)物用來判斷是否存在交叉污染。分型結(jié)果用字符數(shù)據(jù)形式表示，并用Bionumeric6.6進(jìn)行分析。使用Hunter-Gaston分辨力指數(shù)(HGDI)評價每個位點(diǎn)的分辨能力。

2 結(jié)果

2.1Spoligotyping結(jié)果668個菌株共分成了35個不同的基因型。8株的SIT與SpolDB 4.0數(shù)據(jù)庫及其升級版本SITVIT兩個數(shù)據(jù)庫中所有已鑒定菌株均不匹配，因此被定義為未知菌株。北京型家族基因型菌株有558(83.53%)株，其中546株為典型北京型家族基因型(SIT1)，表現(xiàn)為前34個間隔區(qū)缺失，只存在35～43個間隔區(qū)[11]；剩余12株由于缺失1個或多個在經(jīng)典北京型家族存在的間隔區(qū)，被定義為類北京型菌株或非典型北京型菌株。其次是T1家族基因型和MANU2基因型，分別有59(8.83%)株和20(2.99%)株。北京型和T1、MANU2基因型是該地區(qū)主要流行菌株，占總體菌株的95.35%。其余的110株非北京型菌株被分為28個基因型。668株通過成簇分析最終被劃分為10個簇，25個菌株具有獨(dú)特的Spoligotype基因型。由于Spoligotyping對北京型家族分辨能力差，成簇率較高，達(dá)94.7% (表1)。

最小生成樹結(jié)果表明北京型和非北京型菌株分別構(gòu)成了2個大基因簇。最大的簇含有546株典型北京型家族菌株，而非典型北京型菌株組成的小簇圍繞在該簇周圍。右邊第二大基因簇主要含有T1和MANU2家族和其他非北京型家族，而8個未知基因型位于該簇周圍，提示未知基因型菌株在進(jìn)化親緣關(guān)系上可能與非北京型家族更接近(圖1)。

表1 668株結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping結(jié)果

續(xù)表1

圖1 根據(jù)668株菌的Spoligotyping結(jié)果構(gòu)建的最小生成樹

2.2MIRU-VNTR分型結(jié)果26位點(diǎn)MIRU-VNTR分析結(jié)果表明，139株被分成38個簇，最大的簇含有15株，成簇率為15.1%；其余529株表現(xiàn)為獨(dú)立基因型。但Spoligotyping和MIRU-VNTR北京型菌株的分型結(jié)果存在略微偏差，MIRU-VNTR最大的簇主要包含北京型家族菌株，但其中有33株為非北京型家族菌株。

2.3MIRU-VNTR和Spoligotyping對河南菌株的分辨能力為評估MIRU-VNTR不同位點(diǎn)組合的分辨能力，我們比較了26位點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)24位點(diǎn)、15位點(diǎn)和12位點(diǎn)之間以及結(jié)合Spoligotyping后的分辨性能(表2)。26位點(diǎn)、標(biāo)準(zhǔn)24位點(diǎn)和15位點(diǎn)與原始12位點(diǎn)組合相比, 尤其與Spoligotyping組合后,對所有菌株的分辨效能顯著提高。

表2 不同分型方法的分辨性能

通過逐個增加VNTR位點(diǎn)評價累積HGDI值。最終鑒定出10個辨別能力最強(qiáng)的位點(diǎn)，分別為Qub11b、mtub21、miru26、qub26、mtub04、miru10、ETRF、ETRE、miru39和ETRA，其累積HGDI達(dá)到0.996，與26位點(diǎn)的HGDI相近，進(jìn)一步增加其他位點(diǎn)沒有明顯改善累積HGDI值(表3)。

表3 逐個增加MIRU-VNTR位點(diǎn)的累積HGDI

3 討論

河南省是結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，但對該地區(qū)結(jié)核桿菌的分子特征的研究較少。本研究首次利用兩種廣泛使用的分型方法，Spoligotyping和MIRU-VNTR，對河南省結(jié)核桿菌基因多態(tài)性進(jìn)行了研究。北京家族基因型是結(jié)核桿菌東亞譜系中最重要的基因型。該基因型是我國主要的流行菌株，而且在我國北部的比例大于南部。北京家族基因型在北京地區(qū)占82.0%～96.3%[12]，而在南部如廣東、廣西和福建等地流行率較低(25%～55.3%)[13]。在本研究中83.5%的結(jié)核桿菌屬于北京家族基因型，表明該基因型是河南省優(yōu)勢菌株，這與上述研究結(jié)果一致。北京型家族在北方較高的流行可能與該地區(qū)由氣候影響的習(xí)俗相關(guān)[14]。本研究也鑒定出8株新的Spoligotyping類型。小基因簇的大量存在提示了近期傳播的可能性。本研究結(jié)果表明北京家族菌株基因成簇率明顯較高，表明其可能是河南省結(jié)核分枝桿菌近期傳播的優(yōu)勢菌株。

盡管Spoligotyping能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌進(jìn)行有效分型，但它對北京家族菌株分辨能力較差。本研究將668株菌成功分為35個不同的基因型，包括10個簇和25個獨(dú)特Spoligotype。由于Spoligotyping的分辨力較低，我們使用另一種分子分型方法MIRU-VNTR進(jìn)一步分析這些菌株的分子特征[15-16]。對于北京家族分型關(guān)鍵在于選擇合適的VNTR位點(diǎn)。由于結(jié)核分枝桿菌種群結(jié)構(gòu)存在差異，并不需要在任何情況下均使用所有24位點(diǎn)組合。不同的調(diào)查地區(qū)，VNTR位點(diǎn)不同造成了分型效能的差異。為鑒定出一套適合河南結(jié)核分枝桿菌的VNTR位點(diǎn)組合，我們參照之前的研究首先選擇26個位點(diǎn)組合對668株臨床樣本進(jìn)行VNTR分型，得到了567個基因型, 包括38個簇和529個獨(dú)特的基因型，HGDI為0.998。對于北京家族而言，26位點(diǎn)的成簇率(16.12%)明顯低于Spoligotyping(98.74%)。對所有的臨床標(biāo)本而言，26位點(diǎn)的HGDI(0.998)明顯高于Spoligotyping(0.042)。VNTR的成簇率在北京型和非北京型之間存在差異(16.13%vs. 2.7%)，表明在河南地區(qū)北京家族可能具有更強(qiáng)的傳染能力。Spoligotyping和26位點(diǎn)組合后，可將所有668株菌分成576個基因型，但二者組合的成簇率低于26位點(diǎn)的成簇率。

本研究中Spoligotyping和MIRU-VNTR分型結(jié)果存在不一致性。33株雖然Spoligotype判定為非北京基因型，但MIRU-VNTR分析顯示它們的分子特征更接近北京家族。19株Spoligotyping鑒定為北京家族，但VNTR分型表現(xiàn)出非北京家族基因型的特性。這種差異可能是樣本中存在多種結(jié)核分枝桿菌的混合感染所致。迄今為止，沒有一種基于分子標(biāo)記的分型方法能完全準(zhǔn)確地區(qū)分北京家族[17]。

綜上所述，本研究首次報道了河南省結(jié)核分枝桿菌的基因型特征；北京家族基因型為河南省的優(yōu)勢菌株；選擇合適的VNTR位點(diǎn)有助于針對特定地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的分型；我們的結(jié)果鑒定出一套精簡的10位點(diǎn)MIRU-VNTR組合可用于本地區(qū)大部分結(jié)核分枝桿菌的分型，該方法的應(yīng)用將有助于增強(qiáng)河南省結(jié)核病的防控，降低河南省的結(jié)核病負(fù)擔(dān)。