申春一，張 震，田永貴，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052

基于嵌合抗原受體修飾T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)在臨床治療中的安全性及有效性，美國FDA已于2017年批準其上市[1-2]。然而在細胞制備及回輸過程中，大部分CAR-T細胞分化為終末期的效應T細胞(effector T cell，Teff)，在體內(nèi)難以維持長時間的抗腫瘤效應[3]。與Teff相比，記憶性T細胞具有強大的抗腫瘤能力，且在體內(nèi)可以長期存活及分化，有較高的臨床應用價值[4]。記憶性T細胞包括中心記憶性T細胞(central memory T cell，Tcm)和效應記憶性T細胞(effector memory T cell，Tem)，其分化受到多種機制的調(diào)控，已有研究[5]表明代謝在T細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。Teff在分化為記憶性T細胞后其代謝方式由糖酵解轉(zhuǎn)化為脂肪酸氧化和氧化磷酸化，即發(fā)生了代謝重編程[6]。有研究[7]報道，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)作為代謝檢查點可使糖酵解水平增加，而mTOR抑制劑雷帕霉素可抑制這一過程并促進T細胞記憶亞群的分化。作者的前期研究[8]結(jié)果也表明，抑制糖酵解或增加氧化磷酸化水平，可促進記憶性T細胞的形成。蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是一種主要富集在十字花科植物中的天然營養(yǎng)素[9]，其對代謝有調(diào)控作用[10]，可通過影響糖異生過程控制血糖，并在2型糖尿病的治療中顯示出良好效果[11]。有文獻[12]表明SFN可促進脂肪細胞褐化/脂肪酸氧化和葡萄糖有氧氧化。因此，本研究檢測SFN處理后人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)CAR-T細胞糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關酶mRNA的表達，探討SFN對HER2 CAR-T細胞分化及抗腫瘤效應的影響和可能機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gbico公司，人外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司，人CD8分選磁珠、人CD3/CD28活化磁珠購自德國美天旎公司，流式抗體購自美國Biolegend公司，Trizol、Primescript RT reagent Kit購自日本TaKaRa公司，SYBR Green qPCR Master Mix購自德國Roche公司，重組人IL-2購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司。

1.2HER2CAR-T細胞的制備及分組參考文獻[13]分離、獲取CD8+T細胞。采用序列合成方法將識別HER2抗原的HER2-scFv連接至CD28和CD3的信號區(qū)，再將其亞克隆入慢病毒載體中，測序驗證HER2 CAR載體構(gòu)建成功后，通過病毒包裝(293T系統(tǒng))及T細胞感染獲得HER2 CAR-T細胞(效率達到60%以上)。將HER2 CAR-T細胞鋪于24孔板中，每孔1×106個，設置為對照組及SFN組(加15 μmol/L SFN)，處理72 h后進行下列指標的檢測。

1.3兩組HER2CAR-T細胞分化的檢測收集兩組HER2 CAR-T細胞于1.5 mL離心管中，用PBS洗滌，避光加入CD8-APC-Cy7、CD45RO-PE和CCR7-PerCP，4 ℃孵育20 min后上流式細胞儀檢測。CD45RO-CCR7+為Tn細胞，CD45RO+CCR7+為Tcm細胞，CD45RO+CCR7-為Tem細胞，CD45RO-CCR7-為Teff細胞。

1.4兩組HER2CAR-T細胞中細胞內(nèi)因子的檢測以A549為靶細胞，以HER2 CAR-T細胞為效應細胞，按效靶比為10∶1共孵育，同時加入阻斷劑BFA(1×)。6 h后收集細胞，PBS清洗后避光加入CD8-APC-Cy7，避光4 ℃孵育20 min后固定破膜，再避光加入胞內(nèi)抗體IFN-γ-PE-Cy7和TNF-α-APC，檢測兩組細胞內(nèi)IFN-γ及TNF-α的分泌水平。每組設3個復孔。實驗重復3次。

1.5兩組HER2CAR-T細胞殺傷能力的檢測以A549為靶細胞，以HER2 CAR-T細胞為效應細胞，設置效靶比分別為1∶1、5∶1和10∶1，共孵育6 h。采用Annexin V和PI雙染法檢測細胞凋亡情況。細胞凋亡率越高代表HER2 CAR-T細胞的殺傷能力越強。每組設3個復孔。實驗重復3次。

1.6兩組HER2CAR-T細胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關基因的檢測將HER2 CAR-T細胞離心棄上清，加入1 mL Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后行PCR。反應體系(20 μL)：cDNA 2 μL，SYBR GREEN染料10 μL，上、下游引物(1 μmol/L)各4 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min延伸。每組設3個復孔。實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析。引物及序列見表1。實驗重復3次。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

HK2：己糖激酶2；PFKM和PFKP：磷酸果糖激酶；PKM：丙酮酸激酶；CPT1A：肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，應用兩獨立樣本的t檢驗比較兩組細胞分化、細胞內(nèi)因子分泌水平、細胞殺傷能力、細胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關酶mRNA表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組HER2CAR-T細胞分化的比較見表2。由表2可知，與對照組相比，SFN處理后Tcm細胞比例升高。

表2 兩組HER2 CAR-T細胞分化的比較(n=3) %

2.2兩組HER2CAR-T中細胞內(nèi)因子分泌水平的比較見表3。由表3可知，與對照組相比，SFN能促進HER2 CAR-T細胞內(nèi)因子的分泌。

表3 兩組HER2 CAR-T細胞內(nèi)因子分泌水平的比較

2.3兩組HER2CAR-T細胞對A549殺傷能力的比較見表4。由表4可知，SFN組A549凋亡率高于對照組。

表4 兩組HER2 CAR-T細胞對A549殺傷能力的比較 %

2.4兩組HER2CAR-T細胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關酶mRNA的表達結(jié)果見表5。由表5可知，經(jīng)SFN處理后，HER2 CAR-T細胞糖酵解途徑關鍵酶mRNA表達水平較對照組降低，脂肪酸氧化過程相關酶CPT1A mRNA表達水平較對照組升高。

表5 兩組HER2 CAR-T細胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關酶mRNA的表達(n=3)

3 討論

SFN被看作是已知的所有天然抗癌物質(zhì)中效果最好的活性成分，在體外和體內(nèi)實驗中均證實可以誘導多種腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯[14-15]。作者的前期研究[16]發(fā)現(xiàn)SFN可促進CD8+T細胞記憶前體細胞的分化。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)SFN處理后HER2 CAR-T細胞記憶性T細胞亞群分化增多，IFN-γ及TNF-α分泌水平和殺傷活性增加，提示采用SFN處理CAR-T細胞有望成為體外擴增記憶性T細胞亞群并增強其功能的一種方法。

在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞的代謝特征被稱為Warburg效應，即在有氧條件下，腫瘤細胞也主要以無氧糖酵解的方式提供能量[17]。T細胞在靜息狀態(tài)下的代謝方式為氧化磷酸化，而經(jīng)過刺激后其代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒鈁18]。CAR-T細胞也有相似的分化過程與代謝模式，如何通過調(diào)節(jié)代謝方式獲得記憶性細胞是研究的重點。目前通過調(diào)節(jié)代謝影響T細胞分化的藥物主要集中在靶向代謝檢查點的激活劑或抑制劑[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，SFN可抑制HER2 CAR-T細胞的糖酵解途徑關鍵酶mRNA的表達，促進記憶亞群的形成。但SFN調(diào)控T細胞糖酵解的具體分子機制尚未闡明，有待進一步探究。

目前對于腫瘤患者的治療提倡采用多種手段聯(lián)合的綜合治療，CAR-T過繼回輸治療與免疫檢查點抑制劑、靶向藥物等相結(jié)合，可獲得更好的療效[21-22]。本研究結(jié)果表明，SFN不僅促進記憶性T細胞的形成，還可增強其功能，因此將CAR-T細胞與SFN聯(lián)合治療可獲得更好的抗腫瘤效果。

綜上所述，本研究在體外實驗證明了經(jīng)SFN處理后HER2 CAR-T細胞抗腫瘤功能得到增強，并揭示了SFN可能通過抑制HER2 CAR-T細胞糖酵解途徑促進記憶亞群形成，這為CAR-T細胞與SFN聯(lián)用治療腫瘤提供了實驗基礎。