李 紅，張 震，黃建敏，趙 璇，楊雙寧，段曉冉，張 毅

1) 鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2) 鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 3) 鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 4) 河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052

隨著生活方式以及環(huán)境的改變，癌癥的死亡人數(shù)逐年攀升[1]。據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的2017年中國腫瘤現(xiàn)狀和趨勢報告：中國癌癥發(fā)病人數(shù)約占全球的22%，癌癥死亡約占全球的27%，成為導致中國居民的主要死亡原因, 其中肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居首位[2-3]。目前惡性腫瘤的主要治療手段包括傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療等在內(nèi)的綜合治療措施。隨著腫瘤學、免疫學和分子生物學等相關學科的迅速發(fā)展，腫瘤免疫治療作為一種新的抗腫瘤治療手段，臨床效果已經(jīng)得到了驗證，并成為腫瘤綜合治療的重要組成部分[4]。大量研究[5-8]顯示，細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cell, CIK)、腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte cell, TIL)、樹突狀細胞(dendritic cell, DC)、自然殺傷性細胞(natural killer cell, NK)、嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)等免疫細胞治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、腎癌、肺癌和淋巴瘤等均取得了較好的臨床療效。本課題組采用CIK細胞治療聯(lián)合常規(guī)療法治療了30例晚期肺癌患者，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2014年1月至2015年1月鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心收治的59例晚期肺癌患者。入組患者均經(jīng)過手術(shù)和(或)多療程放化療等既往治療，KPS≥75分，無明顯免疫抑制，無活動性感染，無重大器官功能障礙。30例接受生物治療并符合生物治療適應證，余29例(對照組)接受以鉑類為基礎的雙藥聯(lián)合等化療方案。該研究通過醫(yī)院倫理委員會審批，患者簽署知情同意書。兩組基本情況見表1。

表1 兩組患者的臨床指標的比較

1.2CIK組治療方案CIK組的治療方案見圖1。

圖1 CIK細胞治療組的臨床流程

1.2.1 CIK細胞的制備 采血前評估患者的血常規(guī)符合以下標準：白細胞計數(shù)>3×109個/L、淋巴細胞計數(shù)>0.6×109個/L、凝血酶原活動度(PTA)>50%，血小板計數(shù)(PLT)>80×109個/L、血紅蛋白>100～150 g/L。抽取患者外周血50～100 mL，利用梯度離心法獲得單個核細胞，計數(shù)后以2×106個/mL懸浮于50 mL GT-T551培養(yǎng)基(TaKaRa公司)中，置于含青、鏈霉素雙抗、重組人IFN-γ(1 000 U/mL，PeproTech公司)的培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分數(shù)5%CO2)中培養(yǎng)。24 h后加入CD3單抗(25 μg/L，eBioscience公司)、重組人IL-2(1 000 U/mL，北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司)，隔天觀察細胞生長情況并更換培養(yǎng)液，直至完成14 d的細胞培養(yǎng)周期。誘導前后檢測細胞表型(CD3、CD4、CD8、CD56)。

1.2.2 CIK細胞的回輸 采用臺盼藍染色法檢測CIK細胞終制劑的活細胞數(shù)量，活細胞數(shù)量應在90%以上。每批次細胞制劑在細胞回輸前3 d取樣質(zhì)檢(包括無菌檢測和真菌)。質(zhì)檢合格后方可進行細胞回輸。采用靜脈滴注回輸。每次回輸前須評估患者的生命體征及心肺功能狀態(tài)。如果患者體溫高于38 ℃、血常規(guī)結(jié)果或主要臟器功能異常則不建議細胞回輸。每個療程包含6個周期，每次回輸在傳統(tǒng)治療結(jié)束后3 d內(nèi)開始，并以劑量爬坡的方式連續(xù)回輸3 d(第1天10%，第2天30%，第3天60%)。每次回輸?shù)募毎麛?shù)量不低于5×109個，每個療程回輸?shù)募毎麛?shù)應不低于1010個。首次接收細胞回輸?shù)幕颊?、老年人或兒童須密切觀察生命體征等變化。如果在回輸過程中出現(xiàn)體溫升高、過敏反應等則暫?；剌敳⒔o予對癥處理。

1.3臨床療效及安全性評估根據(jù)實體瘤療效評價標準(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)評估臨床療效。CIK組在完成最后一次細胞回輸后4周進行評估，并按照治療方案在細胞回輸后每3個月(第1年)和之后每6個月(2 a后)進行復查和隨訪，包括血常規(guī)檢查和影像學檢查等。對照組在每次放化療結(jié)束后評估臨床療效。根據(jù)美國國立癌癥研究院通用毒性標準4.0版進行不良事件和安全評價。對生存結(jié)果進行電話隨訪分析，記錄死亡時間。以確診時間為起始事件，隨訪終止、失訪或死亡作為終點事件。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行分析，應用χ2檢驗比較兩組患者臨床資料和生活質(zhì)量的差異，應用配對t檢驗分析CIK組患者治療前后免疫細胞表型的變化；K-M法繪制兩組的生存曲線并行l(wèi)og-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1CIK組患者外周血免疫細胞表型變化CIK組患者外周血誘導前CD3+T細胞比例偏低，且以CD3+CD4+T細胞為主；部分患者存在CD4+CD8+T細胞比例倒置。誘導后，CD3+CD56+細胞比例提高(表2)，CD3+T細胞比例達90%以上，并且以CD3+CD8+T細胞為主要效應性細胞。

表2 CIK組患者外周血中免疫細胞誘導前后表型的比較(n=30) %

2.2兩組患者治療相關的不良反應和生活質(zhì)量比較在CIK細胞回輸過程中，部分患者出現(xiàn)一過性體溫升高(多為低、中度發(fā)熱)，不需特殊處理可自行緩解。有3例患者出現(xiàn)高熱,2例患者出現(xiàn)寒戰(zhàn)，對癥處理后均能迅速緩解。1例患者回輸細胞后出現(xiàn)惡心、嘔吐等消化道癥狀；2例患者出現(xiàn)肌肉酸困、乏力，多可自行緩解。全部患者均能順利完成CIK細胞治療周期，在回輸過程中未出現(xiàn)危及生命或?qū)е轮委熤袛嗟膰乐夭涣挤磻?。與對照組比較，CIK組在精神狀態(tài)和體力方面改善更明顯(P<0.05)，而睡眠質(zhì)量和飲食方面變化不明顯(表3)。

表3 CIK組和對照組生活質(zhì)量的變化例(%)

2.3兩組臨床療效CIK組有2例治療2個月后局部腫瘤病灶明顯縮小(圖2、3)；其余28例及對照組患者均未見病灶明顯縮小。

CIK組和對照組生存曲線差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.156，P=0.041)，中位生存期[M(P75，P25)]分別為29(24，45)個月和12(9，18)個月，CIK組中位生存期明顯長于對照組(圖4)。

圖2 一例肺癌患者CIK治療前(A)后(B)左肺部病灶CT表現(xiàn)

圖3 一例肺癌患者CIK治療前(A)后(B)右肺部病灶CT表現(xiàn)

圖4 CIK組和對照組患者的生存曲線

3 討論

近年來，人們逐漸認識到機體的免疫調(diào)節(jié)對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著巨大影響，免疫治療手段也被證實具有較好的臨床療效，因此腫瘤治療理念在逐漸改變與更新?；熕幬镫m然可以殺傷腫瘤細胞進而在一定程度上抑制腫瘤生長，然而不可避免地耐藥、復發(fā)以及嚴重副作用等問題，無法給更多肺癌患者帶來長期獲益，特別是晚期肺癌患者的生活質(zhì)量受到嚴重影響。腫瘤免疫治療的理念是重建免疫系統(tǒng)，促進免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞，延緩病情進展，提高生活質(zhì)量。CIK細胞表達CD3和CD56兩種膜蛋白，兼具T淋巴細胞的抗瘤活性和非MHC限制性殺瘤特點。研究[9]表明，與LAK、TIL、NK和CAR-T細胞相比，CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤譜廣、抗腫瘤活性強、副作用輕微等特點。此外，CIK細胞可以通過多種機制殺傷腫瘤細胞，包括通過穿孔素及顆粒酶直接殺傷靶細胞，分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等多種細胞因子，增強細胞毒作用、高表達FasL，誘導腫瘤細胞的凋亡和壞死。

有文獻[10-13]報道，免疫細胞如CIK、DC-CIK、TIL、CAR-T等細胞療法對多種惡性腫瘤均有較明顯療效。早期的腫瘤患者更多地關注和受益于生存期的延長，而晚期腫瘤患者更多關注生活質(zhì)量的提升與改善[5]。本組經(jīng)CIK治療的肺癌晚期患者中多數(shù)自覺飲食、睡眠和體力等方面有所改善。本組常見的不良反應為發(fā)熱及體溫升高，且均為一過性(發(fā)生率為10%)，與文獻[14]報道基本一致。體溫升高常發(fā)生在細胞回輸后1～6 h，可自行緩解。個別患者出現(xiàn)高熱，對癥處理后能夠迅速緩解。在CIK治療前后，患者的主要器官如肝、腎功能正常，無明顯變化，提示CIK治療不會造成肝、腎功能的損傷。

本研究中CIK組多數(shù)患者的瘤體沒有出現(xiàn)明顯改變，僅2例患者治療后瘤體有較為明顯縮?。粚φ战M病灶均未縮小。文獻[15]報道，接受PD-1/PD-L1治療后有15%患者出現(xiàn)假性進展，影像學表現(xiàn)為瘤體增大25%甚至出現(xiàn)新的病灶，然而后期影像學的結(jié)果顯示病情未被評估為腫瘤進展或者疾病進展。與傳統(tǒng)的腫瘤治療模式不同，接受CIK治療的患者早期影像學結(jié)果較難鑒別為臨床應答或非臨床應答(基于這些影像技術(shù)的有限性)，從而表現(xiàn)出特殊的臨床應答模式(假性進展和延遲反應)或提示增大的瘤體，可能與腫瘤微環(huán)境中浸潤的淋巴細胞歸巢至腫瘤部位有關。因此，使用傳統(tǒng)的RECIST療效評價標準或許已不能準確評估免疫細胞治療這一新興技術(shù)的臨床療效，而需要更加完善與規(guī)范的評估標準[16-17]。此外，本研究中的病例數(shù)較少，其臨床療效需要在以后較大規(guī)模的臨床研究中加以證實。

綜上所述，此次臨床觀察初步證實了CIK治療晚期肺癌的臨床不良反應較為輕微，大多數(shù)患者可耐受；同時患者的生活質(zhì)量得到提升，特別是在精神狀態(tài)和體力恢復方面改善明顯；此外，患者的中位生存期明顯延長，說明CIK治療晚期肺癌具有一定的臨床受益；然而CIK治療的具體作用機制和長期療效仍需進一步的研究和驗證。相信隨著免疫細胞治療的規(guī)范化，以及與傳統(tǒng)腫瘤治療手段的有效聯(lián)合，免疫細胞治療有望為腫瘤的臨床治療提供更好的選擇。