楊惠雲(yún),秦國慧,楊 黎,張 毅1,

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州450052 4)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052

食管癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，而中國地區(qū)90%以上為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，盡管近幾年食管癌治療效果不斷提高，但5 a生存率仍只有15%～25%，迫切需要治療手段[1-2]。近年來，免疫治療在腫瘤治療領(lǐng)域取得矚目的效果，并有望成為一種能夠攻克癌癥的治療方法[3-4]。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)是腫瘤賴以生存和進展的環(huán)境，除了腫瘤細胞、基質(zhì)細胞和免疫效應(yīng)細胞，還存在免疫抑制性細胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細胞、腫瘤相關(guān)成纖維細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)等，這些細胞通過抑制機體免疫反應(yīng)，促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[5-6]。其中MDSCs是一群異質(zhì)性細胞，根據(jù)細胞學(xué)形態(tài)，人源性MDSCs分為單核MDSCs(M-MDSCs)和多形核MDSCs(PMN-MDSCs)兩個亞群[7]。有研究[8-9]報道程序性細胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1，PD-1)和T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3，TIM-3)是在免疫效應(yīng)細胞上表達的共抑制受體，分別與其配體結(jié)合后可以促進免疫逃逸，抑制免疫系統(tǒng)功能。PD-1在小鼠乳腺癌組織來源的MDSCs上有表達，并可促進腫瘤進展[10]。本研究檢測了PD-1和TIM-3在ESCC患者腫瘤組織和外周血來源的M-MDSCs和PMN-MDSCs上的表達，分析了其與患者預(yù)后及臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象ESCC患者術(shù)后腫瘤組織(48例)和配對的外周血(48例)均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診者，其中男32例，女16例；<65歲35例，≥65歲13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例；組織學(xué)分級：G1、G2級36例，G3級12例；TNM分期：Ⅰ、ⅡA期25例，ⅡB、Ⅳ期23例；浸潤深度：T1、T2 13例，T3、T4 35例。該研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得患者以及家屬的知情同意。

1.2腫瘤組織單細胞懸液的制備在無菌操作臺中快速將腫瘤組織剪成3～4 mm的碎塊，加入RPMI 1640無血清培養(yǎng)基和三酶消化液，37 ℃振蕩30 min，用70 μm細胞濾器過濾獲得單細胞懸液，離心后棄上清，加入無菌PBS重懸。

1.3外周血單個核細胞(PBMCs)懸液的制備于無菌操作臺中操作。將20 mL ESCC患者外周血用無菌PBS稀釋成30 mL。在50 mL離心管中倒入15 mL人外周血淋巴細胞分離液，小心將血液稀釋液倒入淋巴細胞分離液上層(注意不要擾亂液體界面)，室溫下2 500 r/min離心25 min；用吸管吸取白膜層到新的離心管中，加無菌PBS到50 mL，室溫下1 500 r/min離心10 min；棄上清，加入無菌PBS重懸。

1.4MDSCs上PD-1和TIM-3表達的檢測本課題組前期研究[1,7]結(jié)果顯示CD11b+CD14+CD33+HLA-DR-/low可以標(biāo)記M-MDSCs, 而CD11b+CD14-CD33+HLA-DR-/low可以標(biāo)記PMN-MDSCs。腫瘤組織單細胞和外周血PBMCs計數(shù)后各取1×106個，離心后棄上清，用flow buffer(含體積分數(shù)2%血清的無菌PBS)重懸，避光條件下分別加入流式抗體CD11b-PE-Cy7、CD14-APC-Cy7、CD33-PE、HLA-DR-APC、TIM-3-PE、PD-1-FITC和7AAD-PerCP。4 ℃避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。

1.5隨訪及生存分析通過電話進行隨訪，并記錄隨訪結(jié)果，以死亡或失訪為終點事件，隨訪截止日期為2018年11月31日?？偵鏁r間為術(shù)后至死亡或末次隨訪時間。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行分析，應(yīng)用兩相關(guān)樣本的秩和檢驗比較PD-1和TIM-3在腫瘤組織和外周血來源的MDSCs上表達的差異，應(yīng)用兩獨立樣本的秩和檢驗比較不同臨床病理特征的食管鱗癌患者PD-1和TIM-3表達的差異；應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并行l(wèi)og-rank檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1ESCC患者腫瘤組織和外周血來源的MDSCs上PD-1和TIM-3的表達結(jié)果見表1。 由表1可知，腫瘤組織來源的MDSCs上PD-1和TIM-3的表達水平高于外周血(P<0.001)。PD-1和TIM-3在腫瘤組織來源的PMN-MDSCs上的表達水平高于M-MDSCs(P<0.05)。

表1 腫瘤組織和外周血來源的MDSCs上PD-1和TIM-3表達的比較(n=48) %

2.2PD-1和TIM-3在腫瘤組織和外周血來源的MDSCs上的表達與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系結(jié)果見表2、3。PD-1在外周血來源M-MDSCs上的表達與性別有關(guān)，而與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、TNM分期及浸潤深度等臨床病理指標(biāo)無關(guān)。TIM-3在外周血和腫瘤組織來源的MDSCs上的表達與上述臨床病理指標(biāo)均無關(guān)。

2.3腫瘤組織來源的PMN-MDSCs上PD-1和TIM-3的表達與患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)果見圖1。腫瘤組織來源的PMN-MDSCs上，PD-1、TIM-3高表達和低表達患者生存曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.395和0.066,P均>0.05)。

表2 PD-1在腫瘤組織和外周血來源的MDSCs上的表達與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 %

表3 TIM-3在腫瘤組織和外周血來源的MDSCs上的表達與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 %

圖1 PD-1(左)、TIM-3(右)高、低表達患者的生存曲線比較

3 討論

MDSCs在多種腫瘤發(fā)生過程中被動員，是促進腫瘤血管形成并破壞免疫監(jiān)視的主要機制。在腫瘤微環(huán)境中，MDSCs通過上調(diào)ARG1、iNOS、ROS1等抑制性分子的表達，抑制T細胞的增殖與功能[11-12]。PD-1和TIM-3是兩個抑制性受體，通常表達在免疫效應(yīng)細胞上，與其配體結(jié)合后可以抑制免疫應(yīng)答[9,13]。近期研究[10]表明，在4T1乳腺癌小鼠模型中，PD-1在腫瘤組織來源MDSCs上的表達升高；在腫瘤微環(huán)境中，PD-1+MDSCs的增殖和其表面抑制性分子的表達被充分誘導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，ESCC患者腫瘤組織來源的MDSCs(M-MDSCs和PMN-MDSCs)上PD-1和TIM-3的表達均較外周血來源的MDSCs增加。

有研究[11,14]顯示，在胃癌組織中，PMN-MDSCs聚集更多，并且有更強的免疫抑制功能。本研究結(jié)果顯示，ESCC患者腫瘤組織來源的MDSCs中，PD-1和TIM-3在PMN-MDSCs上的表達高于M-MDSCs。

本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織來源的PMN-MDSCs上PD-1、TIM-3高表達和低表達患者的總生存時間沒有差異。腫瘤組織或外周血來源的兩個MDSCs亞群上PD-1和TIM-3的表達與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、TNM分期及浸潤深度均無關(guān)。

綜上所述，PD-1和TIM-3在ESCC患者腫瘤組織來源的兩個MDSCs亞群上表達升高，并且可能增加MDSCs的免疫抑制功能，但是其機制還不清楚；PD-1和TIM-3在ESCC患者MDSCs上的表達是否通過調(diào)控MDSCs免疫抑制功能從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)還需要進一步研究證實。