王潤(rùn)霞,王秀芳,謝安建,沈玉華,周建慶,邾枝花

(1.安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,安徽 合肥 230039;2.安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校,安徽 合肥 230601)

生物體中存在著許多生物礦物，這些生物礦物中包含的無(wú)機(jī)物是自然界常見(jiàn)的無(wú)機(jī)礦物，如草酸鈣、碳酸鈣和磷酸鈣等.生物礦化是指在有機(jī)基質(zhì)調(diào)控和參與下生物礦物在生物體內(nèi)的形成過(guò)程，尿結(jié)石是生物體內(nèi)病理礦化的產(chǎn)物，其中70%～80%的晶體成分為草酸鈣(CaOxa)，它有三種水合物形式：即熱力學(xué)穩(wěn)定的一水草酸鈣(CaOxa(H2O，COM)、亞穩(wěn)態(tài)的二水草酸鈣(CaOxa(2H2O，COD)和熱力學(xué)不穩(wěn)定的三水草酸鈣(CaOxa(3H2O，COT).由于COM是熱力學(xué)穩(wěn)定狀態(tài)，因此是結(jié)石中最普遍的晶型，約占70%以上[1].由于COD表面呈電中性，其與細(xì)胞膜表面的粘附能力大約是COM的二分之一，與腎小管細(xì)胞的接觸程度較小，與腎小管細(xì)胞表面結(jié)合力較弱，比COM更容易隨尿排出體外[2].因此，抑制COM形成或穩(wěn)定COD在尿液中的存在，有利于治療草酸鈣結(jié)石.

中草藥治療尿結(jié)石具有副作用小、價(jià)格便宜和療效明顯等優(yōu)點(diǎn)，已成為治療尿結(jié)石的重要醫(yī)療手段，但其治療機(jī)制至今尚不清楚.本課題組曾研究了金錢(qián)草[3]、烏梅[4]、玉米須[5]等植物對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)的抑制作用，探索了抑制因素的作用原理，為臨床尋求防治尿結(jié)石的新藥提供了一定的理論支持.目前治療尿結(jié)石的中草藥使用較多的是“三金”(金錢(qián)草、雞內(nèi)金、海金沙)、“二子”(冬葵子、車(chē)前子)、“二石”(石韋、滑石)等組成的合劑[6]，其中海金沙草系海金沙科Lygodiaceae海金沙屬Lygodium多年生蕨類(lèi)植物海金沙的地上部分.本文采用體外模擬方法研究了單味中藥海金沙提取液對(duì)草酸鈣結(jié)晶的影響，從化學(xué)配位和草酸鈣晶相等角度討論了其抑制草酸鈣結(jié)石的化學(xué)基礎(chǔ)，這將為臨床使用海金沙作為治療尿結(jié)石的有效藥物提供理論依據(jù)和支持.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

草酸鈉(北京化工廠)，無(wú)水氯化鈣(上海泗聯(lián)化工廠)均為分析純，水為二次水.海金沙為廣西所產(chǎn)，來(lái)源于多年生蕨類(lèi)植物海金沙的地上部分的干燥全草.

傅立葉變換紅外光譜在NEXUS-870 型紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet 公司)上測(cè)試；掃描電子顯微鏡(SEM)為S4800 型(日本)，加速電壓10KV；物相測(cè)試用MAP18XAHF 型X-射線(xiàn)衍射儀完成，測(cè)試電壓40KV，電流100mA，掃描速度4o/min.DDS-11A電導(dǎo)率儀(上海理達(dá)儀器廠).TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海金沙提取液的制備

取海金沙400 g，加二次蒸餾水4000 ml，煮沸60 min，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加二次蒸餾水4000 ml，煮沸40 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮成含生藥0.05 g·ml-1， 0.2 g·ml-1， 0.4 g·ml-1，0.8 g·ml-1的海金沙提取液，用高速離心機(jī)進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速為11000轉(zhuǎn)/分)，取上清液備用.

1.2.2 海金沙對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)的影響

在一只潔凈的燒杯中分別加入5 mmol·L-1的CaCl2溶液50 ml，二次蒸餾水50 ml和5 mmol·L-1的Na2C2O4溶液50 ml，攪拌均勻，反應(yīng)10 min，靜置陳化2 h，離心分離，所得樣品干燥后待測(cè).分別替換二次水為含生藥0.05g·ml-1，0.2g·ml-1，0.4g·ml-1，0.8g·ml-1的海金沙提取液，同法操作，所得樣品干燥后待測(cè).

1.2.3 草酸鈣結(jié)晶動(dòng)力學(xué)研究

結(jié)晶動(dòng)力學(xué)通過(guò)測(cè)定溶液電導(dǎo)率變化來(lái)監(jiān)測(cè).向25ml濃度為5mmol·L-1的CaCl2溶液中加入25ml二次蒸餾水，再加25ml濃度為5mmol·L-1的Na2C2O4溶液，測(cè)定所得溶液的電導(dǎo)率，測(cè)定過(guò)程中用恒定速度攪拌被測(cè)溶液.然后分別用生藥濃度為0.05g·ml-1和0.4g·ml-1的海金沙提取液替換二次蒸餾水，同法測(cè)定電導(dǎo)率.

2 結(jié)果與討論

2.1 海金沙對(duì)草酸鈣晶體形成的影響

2.1.1 草酸鈣晶體的SEM照片

圖1 加入不同濃度海金沙提取液后草酸鈣晶體的SEM圖像(a)0g·ml-1，(b)0.05g·ml-1，(c)0.2g·ml-1，(d)0.4g·ml-1，(e)0.8g·ml-1of lygodium extract，respectively

不同條件下制得的草酸鈣晶體的形貌通過(guò)掃描電鏡觀察.圖1a為未加海金沙提取液的水溶液中形成的草酸鈣晶體照片，照片顯示草酸鈣晶體為不規(guī)則的六邊形片狀結(jié)構(gòu)，并且聚集成菊花狀，這種六邊形片狀結(jié)構(gòu)的草酸鈣是COM型晶體[7]，因此可以推測(cè)在未加海金沙提取液形成的草酸鈣晶體是COM型.圖1b為加入0.05 g·ml-1提取液后形成的草酸鈣晶體照片，照片顯示有兩種形貌的草酸鈣晶體，一種是與圖1a中晶體相似的大小不一的不規(guī)則的六邊形片狀結(jié)構(gòu)的COM型晶體，另一種是四方錐形晶體，此為COD晶體[8]，晶體的邊長(zhǎng)約4.5μm，棱長(zhǎng)約2.5μm，因此可以推測(cè)，加入0.05 g·ml-1海金沙提取液后形成的是COM與COD混合的草酸鈣晶體.圖1c為加入0.2 g·ml-1海金沙提取液后形成的草酸鈣晶體照片，與圖1b相似，也有兩種形貌的晶體，一種是大小不一的六邊形片狀的COM晶體，另一種是大小不一的四方錐形的COD晶體，晶體的平均邊長(zhǎng)約3μm，平均棱長(zhǎng)約1.5μm，因此可以推測(cè)，加入0.2 g·ml-1海金沙提取液后形成的也是COM與COD混合的的草酸鈣晶體，所得COD晶體比圖1b中的小.圖1d為加入0.4 g·ml-1提取液后形成的草酸鈣晶體的SEM圖像，照片中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)片狀六邊形COM晶體，只有大小均勻的四方錐形的COD型晶體.圖1e為加入0.8 g·ml-1提取液后形成的草酸鈣晶體的SEM圖像，圖中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)片狀六邊形晶體，與圖1d比較，晶體由四角雙錐形變?yōu)樗慕请p錐柱形，兩端的錐形面更趨于圓鈍，柱體長(zhǎng)約為0.5μm，晶體明顯要比1d中晶體的尺寸小，初步推測(cè)，此條件下所得草酸鈣也只是COD型的晶體.從上述討論可以推測(cè)海金沙提取液不僅可以抑制COD晶體向COM晶體轉(zhuǎn)化，而且隨海金沙提取液濃度增大COD晶體尺寸隨之減小.

2.1.2 草酸鈣晶體的FTIR光譜

圖2 加入不同濃度海金沙提取液后草酸鈣晶體的FTIR譜圖(a) 0 g·ml-1，(b) 0.05 g·ml-1，(c) 0.4 g·ml-1，(d) 0.8 g·ml-1of lygodium extract，respectively

圖2所示為加入不同濃度海金沙提取液后生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FTIR譜圖.在不加海金沙提取液生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FTI R光譜如圖 2a所示，COO-的伸縮振動(dòng)帶ν(COO-)為1318 cm-1，反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)帶νas(COO-)以雙峰出現(xiàn)，雙峰位置分別在1618cm-1和1650 cm-1，峰位置與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的COM和COD晶體吸收峰吻合，在指紋區(qū)內(nèi)，為COM的特征峰657 cm-1，這表明，此時(shí)生成的草酸鈣晶體主要為COM[10].在0.05g·ml-1海金沙提取液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FTIR光譜如圖 2b所示，COO-的伸縮振動(dòng)帶ν(COO-)為1326 cm-1，νas(COO-)也以雙峰出現(xiàn)，雙峰位置分別在1618cm-1和1650 cm-1，在指紋區(qū)內(nèi)，又出現(xiàn)雙峰，分別為COM的特征峰657 cm-1和COD的特征峰618cm-1，表明形成的晶體為COM和COD的混合物[9].在0.4 g·ml-1海金沙提取液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FTIR光譜如圖 2c所示，COO-的伸縮振動(dòng)帶ν(COO-)為1326 cm-1，νas(COO-)也以雙峰出現(xiàn)，雙峰位置分別在1618cm-1和1650 cm-1，在指紋區(qū)COD的特征峰出現(xiàn)在918，616cm-1處，表明此時(shí)形成的草酸鈣晶體主要為COD型.在0.8 g·ml-1海金沙提取液中生長(zhǎng)的草酸鈣晶體的FTIR光譜如圖 2d所示，COO-的伸縮振動(dòng)帶ν(COO-)為1326 cm-1，νas(COO-)以單峰出現(xiàn)，峰位置分別在1647 cm-1，在指紋區(qū)COD的特征峰出現(xiàn)在918，616cm-1處，表明此時(shí)形成的草酸鈣晶體為COD型，與SEM推測(cè)結(jié)果一致.

2.1.3 草酸鈣晶體的XRD圖

圖3 加入不同濃度海金沙提取液后草酸鈣晶體的XRD圖譜(a) 0 g·ml-1，(b) 0.05 g·ml-1，(c) 0.2 g·ml-1，(d) 0.4 g·ml-1，(e) 0.8 g·ml-1of lygodium extract，respectively

圖4 加入不同濃度海金沙提取液后草酸鈣晶體生長(zhǎng)過(guò)程中溶液電導(dǎo)率和時(shí)間的關(guān)系

2.2 加入不同濃度海金沙提取液后草酸鈣晶體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)研究

加入不同濃度海金沙提取液后草酸鈣過(guò)飽和溶液結(jié)晶沉淀過(guò)程中溶液電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化如圖4所示.從圖4a可以看出，在未加海金沙提取液的水中，加入CaCl2溶液再加入Na2C2O4溶液后，所測(cè)電導(dǎo)率在短時(shí)間內(nèi)迅速下降，1分鐘后電導(dǎo)率基本不變，即達(dá)到沉淀溶解平衡，說(shuō)明Ca2+離子與C2O42-離子反應(yīng)迅速聚集成核.從圖4b可見(jiàn)，加入0.05g·ml-1海金沙提取液后，電導(dǎo)率的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)下降緩慢，1.5分鐘后達(dá)到沉淀溶解平衡.當(dāng)加入0.8 g·ml-1海金沙提取液后(圖4c)，電導(dǎo)率的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)下降更緩慢，2.5分鐘后才達(dá)到沉淀溶解平衡，表明CaC2O4晶體的成核速率隨著海金沙提取液濃度增大變小，這可能是因?yàn)殡S海金沙提取液濃度增大，其中的有效成分與Ca2+絡(luò)合能力增大，抑制了晶體的成核.以上情況說(shuō)明海金沙提取液對(duì)草酸鈣晶體的成長(zhǎng)具有抑制作用，并且隨著海金沙提取液濃度增大，這種抑制作用增強(qiáng).

2.3 海金沙提取液對(duì)草酸鈣結(jié)晶的影響機(jī)理探討

圖5 海金沙提取液的紅外光譜

圖5a是海金沙提取液的紅外光譜，圖中位于1611 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于有機(jī)酸或者多糖中vsC=O的伸縮振動(dòng).圖5 b是海金沙提取液和CaCl2混合液的紅外光譜，從圖中可看出，海金沙提取液和CaCl2混合液的vsC=O的伸縮振動(dòng)峰移至1619 cm-1.這可能是由于海金沙提取液中存在蒙花苷、香葉木苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、(6S,9R)-6-羥基-3-酮-α-紫羅蘭醇-9-O-β-D-葡萄糖苷、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸、正二十五烷酸和正二十六烷酸等成分[12]，含有羧基、羥基、羰基等基團(tuán)，這些基團(tuán)與鈣結(jié)合形成可溶性配位絡(luò)合物，因此vsC=O的伸縮振動(dòng)峰發(fā)生紅移.同時(shí)，蒙花苷、香葉木苷屬黃酮類(lèi)物質(zhì)，黃酮類(lèi)物質(zhì)中的羥基可以與Ca2+配位形成配合物[13],同時(shí)提取液中一些相對(duì)分子質(zhì)量較大的單體成分(如黃酮、糖苷等)不但能與Ca2+形成配合物，而且還能以疏水、交疊、包合等方式形成分子絡(luò)合物，減小Ca2+與Oxa2-的絡(luò)合能力，從而降低CaOxa的過(guò)飽和度，低飽和條件抑制了CaOxa的成核和生長(zhǎng).

在幾種晶型的草酸鈣晶體中，COM在單位面積里具有最多的吸附點(diǎn)，吸附能力最強(qiáng)，而COD在單位面積里具有最少的吸附點(diǎn)，吸附能力最弱.要使COD在水溶液中保持長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性，就需要使用添加劑將COD晶體全部覆蓋[14].本論文中當(dāng)加入海金沙提取液為0.05或0.2 g·ml-1時(shí)，其有效成分可能不足以將形成的COD晶面全部覆蓋，不能完全阻止COD轉(zhuǎn)變?yōu)镃OM，故存在COM和COD兩種晶體.隨著海金沙提取液濃度增大，有效成分與COD的吸附位點(diǎn)鍵合增多.當(dāng)加入海金沙提取液等于或大于0.4 g·ml-1時(shí)，估計(jì)其有效成分在COD上的吸附已達(dá)到最大值，減小了COD晶體的溶解速率，增強(qiáng)了COD晶體在溶液中的熱力學(xué)穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制了COD晶體向COM轉(zhuǎn)變，故此條件下形成的草酸鈣晶體主要為COD型.

3 結(jié)論

綜上所述，海金沙提取液中的有機(jī)分子可以抑制亞穩(wěn)態(tài)草酸鈣晶體COD向熱力學(xué)更為穩(wěn)定的COM轉(zhuǎn)化，并且隨著海金沙提取液濃度的增加，這種抑制效果更加明顯，同時(shí)COD晶體尺寸隨海金沙提取液濃度增大而變小.由于抑制COM晶體的形成及減小COD尺寸均有利于阻止草酸鈣結(jié)石的形成，因此，該結(jié)果為臨床使用海金沙作為防治尿結(jié)石的有效藥物提供了理論支持，并且還可為開(kāi)發(fā)新的防治草酸鈣結(jié)石的中草藥提供啟示.

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