姜榮燕 陳淑英 李希紅

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒內(nèi)科， 山東 泰安 271000)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是新生兒窒息、缺氧的嚴(yán)重并發(fā)癥，易留下腦性癱瘓、智力障礙、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。近年研究表明，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)具有神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)營養(yǎng)作用。本實(shí)驗(yàn)在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型上觀察外源性EPO對一氧化氮(nitric oxide,NO)水平及腦細(xì)胞凋亡的影響，來探討EPO在HIBD中的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1新生7 日齡Wistar大鼠,性別不限,體重12～16g,共101只,山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；缺氧艙及測氧儀由泰山醫(yī)學(xué)院兒科提供；重組人促紅細(xì)胞生成素(RhEPO) 由深圳新鵬生物工程有限公司提供，產(chǎn)品批號20070901；測定NO的試劑盒及細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1新生大鼠HIBD 模型的制備：按Rice法制作, 出生7日的Wistar大鼠，乙醚吸入麻醉后取頸正中切口,分離并以絲線結(jié)扎左側(cè)頸總動脈,術(shù)后恢復(fù)2～3h，后置于2 L密閉容器,于37℃水浴中,以2～3 L/min的速度輸入含8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w,持續(xù)2 h。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動物分組：101只Wistar大鼠隨機(jī)分成3組，假手術(shù)組(n=25)僅游離左側(cè)頸總動脈而不結(jié)扎，不低氧；對照組(生理鹽水組)(n=38)在模型制備后腹腔注射生理鹽水0.5ml/只；實(shí)驗(yàn)組(RhEPO組)(n=38)在模型制備后腹腔注射RhEPO 4000u/kg/只[1]，RhEPO稀釋到0.5 ml。

1.2.3標(biāo)本的制備及檢測：假手術(shù)組于處置后，對照組與實(shí)驗(yàn)組分別于注射藥物后2h，12h，24h，48h，72h，96h斷頭取左側(cè)腦組織稱重，按重量體積比1：9加生理鹽水制成10%腦組織勻漿，3000r/min離心10min，取上清液用硝酸還原酶法測定NO；各組均于術(shù)后24h，自丘腦中1/3平面行冠狀切片，4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片，Tunel染色，不加標(biāo)記溶液的為陰性對照，具體操作按說明書進(jìn)行。觀察各組大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞核中含有棕色顆粒的陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1腦組織中NO檢測結(jié)果：

以假手術(shù)組為正常對照，對照組于HIBD后2h即升高(P<0.05)，12-96h顯著高于假手術(shù)組，差異有顯著性意義(P<0.01), 最高值出現(xiàn)在72h，72h后NO值開始下降。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相NO值均低于對照組，24-96h與對照組相比差異有顯著性意義(P<0.01)，見表1。

2.2Tunel染色結(jié)果

Tunel染色檢查假手術(shù)組及陰性對照組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，未見凋亡細(xì)胞；對照組凋亡細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)(118.91±12.32)明顯高于實(shí)驗(yàn)組(59.24±4.92), 差異有顯著性意義(t=3.45,P<0.01)。

表1 三組HIBD后腦組織NO水平變化的比較蛋白)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05，*P<0.01，與對照組比較#P<0.01

3 討 論

EPO是一種耐熱的含唾液酸的酸性糖蛋白，它通過作用于紅系祖細(xì)胞膜表面特異性受體而刺激其增殖、分化及成熟，近年來研究發(fā)現(xiàn)，在大腦皮質(zhì)、小腦、海馬、腺垂體、脊髓中也存在EPO和EPO受體( erythropoietin receptor, EPOR)，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)EPOR[2]，EPO的合成和釋放受多種因素調(diào)控，組織缺氧、缺血是產(chǎn)生EPO的始動因素，腦缺氧、缺血時(shí)通過低氧誘導(dǎo)因子( hypoxia-in-educible factor-HIF-1)的作用，引起EPO和EPOR在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)增加[3]，缺氧缺血時(shí)EPO的高表達(dá)提示它有內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用。但在腦損傷時(shí)內(nèi)源性EPO數(shù)量不足或不能很快生成,使它不能及時(shí)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，于是，人們開始探討應(yīng)用外源性EPO來保護(hù)缺氧缺血腦組織。

EPO對HIBD保護(hù)作用的機(jī)制尚不明確，近期有人[4]比較用RhEPO 治療的HIBD新生鼠腦組織勻漿的NO 及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)水平均比對照組有所降低，說明外源性給予RhEPO 可減少NO的生成。NO是一種高度游離的氣體分子，早期雖然可激活鳥苷酸環(huán)化酶，而具有調(diào)節(jié)腦血管張力及參與細(xì)胞信息傳遞等作用，但過度合成會導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用。大腦缺氧缺血后，可因激活鈣依賴的NOS合成大量N0，過量的NO與O2反應(yīng)，產(chǎn)生毒性更大的過氧化氮(ONOO-),后者是一種高毒性自由基；而非鈣依賴性的誘導(dǎo)型NOS(iNOS)也可在神經(jīng)損傷后激活，在缺血再灌注損傷過程中主要是iNOS產(chǎn)生NO而導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用[5]。本研究顯示，對照組于HIBD后2h NO水平開始升高，12h尤其是24h后NO水平繼續(xù)升高，最高值出現(xiàn)在72-96h，說明腦組織缺氧缺血后生成大量的NO，且隨著缺氧缺血時(shí)間的延長生成量增多；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相NO值均低于對照組，24-96h與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明RhEPO可抑制NO的過量合成，對HIBD有一定的保護(hù)作用。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡在HIBD的發(fā)病中起重要作用，本研究通過Tunel染色證實(shí)經(jīng)RhEPO處理的HIBD新生鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯低于對照組，提示RhEPO抑制HIBD所致的細(xì)胞凋亡是發(fā)揮腦保護(hù)作用的重要環(huán)節(jié)。其機(jī)制[6]為缺氧后HIF-1迅速激活，進(jìn)而星形膠質(zhì)細(xì)胞等表達(dá)釋放EPO，EPO與EPOR結(jié)合，使EPOR形成二聚體, 通過磷酸化作用激活JAK2，JAK2激活后,可導(dǎo)致幾種下游傳導(dǎo)途徑激活,包括Ras蛋白-絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyliNOsitol 3-kinase,PI3K) 途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子5 (signal transducers and activators of transcription,STAT-5) 途徑，將信號逐步下傳，最終抑制神經(jīng)元凋亡 。細(xì)胞凋亡受多種相關(guān)凋亡基因的調(diào)控，其中，Bcl-2基因家族及其編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起著重要作用，如抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl，促凋亡蛋白Bax、Bak等， Kumral等[7]研究發(fā)現(xiàn)EPO可通過下調(diào)Bax的表達(dá),逆轉(zhuǎn)缺血缺氧引起的Bcl-2表達(dá)的減少,而抑制新生兒HIBD引起的細(xì)胞凋亡。

總之，RhEPO可抑制新生鼠HIBD時(shí)腦組織NO的過量產(chǎn)生及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對HIBD起保護(hù)作用，這可能是因?yàn)橥庠葱訣PO雖不易透過完整的血腦屏障，但由于新生動物血腦屏障發(fā)育不完善，同時(shí)缺氧缺血本身進(jìn)一步損傷血腦屏障，從而能使外源性EPO進(jìn)入腦組織發(fā)揮生物效應(yīng)。目前RhEPO已應(yīng)用于臨床，證實(shí)早期治療中、重度新生兒HIE能改善神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,促進(jìn)病情的恢復(fù),且無明顯不良反應(yīng)[8]，因此，RhEPO的應(yīng)用將為新生兒HIE提供一個(gè)嶄新的治療途徑。

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