孫憲昌 張文娟 康頌建

(1.泰山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東 泰安 271000； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

順鉑(CDDP)是一種臨床上常用的廣譜化療藥物，因?yàn)檩^嚴(yán)重的耳毒性，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。研究表明順鉑主要通過(guò)損傷耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋而引起聽(tīng)功能損害；其損傷機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)自由基增多、能量代謝障礙及凋亡密切相關(guān)[1-2]。川芎嗪是中藥川芎的有效成分，具有活血化瘀，改善微循環(huán)，增加耳蝸血流的作用，還有清除自由基減輕生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用，而且最近發(fā)現(xiàn)它還有對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用。臨床上已用于突發(fā)性耳聾等疾病的治療[3-4]。本研究擬觀察川芎嗪是否對(duì)順鉑耳毒性具有保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成熟健康、耳廓反射靈敏、無(wú)中耳疾患的豚鼠30只，體重250～400 g，雌雄不拘；由山東省米歇爾生物制品公司提供。

1.2主要試劑與儀器 順鉑凍干粉(齊魯制藥廠，批號(hào)20060408)；鹽酸川芎嗪注射液(北京市永康藥業(yè)有限公司，批號(hào) 04040501)；TUNEL測(cè)定試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)器材：YJC-A型誘發(fā)電位儀(泰安市高新醫(yī)療器械廠)；解剖顯微鏡。

1.3動(dòng)物分組及用藥 豚鼠隨機(jī)分為三組,每組10只。對(duì)照組：生理鹽水3 ml/(kg·d)腹腔注射6天；順鉑組：順鉑3 mg/(kg·d) 腹腔注射6天；順鉑加川芎嗪組(中藥組)：先腹腔注射川芎嗪140 mg/(kg·d)3天，從第4天起腹腔注射川芎嗪140 mg/(kg·d)30 min后對(duì)側(cè)腹腔注射順鉑3 mg/(kg·d)6天。

1.4聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位(ABR)檢測(cè) 所有動(dòng)物在給藥前和處死前各測(cè)一次ABR，測(cè)試在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。將豚鼠固定后安插針式電極，記錄電極置于顱頂，參考電極和接地電極分別置于同側(cè)和對(duì)側(cè)乳突部，采用YJC-A型誘發(fā)電位儀進(jìn)行檢測(cè)。采用短聲刺激，頻率10次/s，生源距耳1 cm，放大器通頻帶為80～3 kHz,增益4000倍，疊加200次，以波群中III波消失或IV波剛出現(xiàn)時(shí)的短聲刺激強(qiáng)度的dB值為反應(yīng)閾值。記錄各組動(dòng)物ABR閾值及波I潛伏期變化情況。以IV波剛出現(xiàn)時(shí)的短聲刺激強(qiáng)度的dB值為反應(yīng)閾值。

1.5耳蝸基底膜鋪片及琥珀酸脫氫酶(SDH)染色 每組動(dòng)物于末次聽(tīng)力檢測(cè)結(jié)束后,取半數(shù)動(dòng)物耳蝸采用硝基藍(lán)四氮鹽法進(jìn)行SDH染色[5]：動(dòng)物麻醉后迅速斷頭取出雙側(cè)聽(tīng)泡，打開(kāi)聽(tīng)泡，用細(xì)針在蝸尖鉆孔，開(kāi)放圓窗和卵圓窗，用吸管吸取硝基四氮唑藍(lán)(NBT)配制的SDH作用液，從蝸尖小孔處緩慢灌注2～3次，再將耳蝸浸入作用液中于37℃溫箱內(nèi)孵育1～2 h，取出標(biāo)本后用雙蒸水灌洗2～3次，再用10%的甲醛溶液自蝸?lái)敼嗔?次，將標(biāo)本浸入10%中性甲醛溶液中固定24 h。標(biāo)本固定好后在解剖顯微鏡下剝?nèi)ノ仛?，剝離基底膜并放置于滴有甘油的載波片中，中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察毛細(xì)胞形態(tài)及SDH變化。

1.6耳蝸石蠟切片制備 每組動(dòng)物中半數(shù)在最后一次測(cè)試完ABR后，立即斷頭處死，快速取出聽(tīng)泡，暴露耳蝸，用針尖在蝸尖鉆孔，打開(kāi)卵圓窗及圓窗，吸管吸取4%多聚甲醛從蝸尖小孔灌入耳蝸，每個(gè)標(biāo)本灌流4～5次，然后將標(biāo)本浸入固定液中過(guò)夜。固定好的聽(tīng)泡浸入10%EDTA溶液中，室溫下脫鈣2周，以骨質(zhì)軟化為 準(zhǔn)，脫鈣液每日更換1次。常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明，低熔點(diǎn)石蠟包埋，平行與蝸軸方向進(jìn)行連續(xù)切片，片厚5 μm左右。

1.7凋亡細(xì)胞的原位檢測(cè) 采用TUNEL法。選取HE染色較好的能顯示螺旋神經(jīng)節(jié)及Corti氏器的石蠟切片進(jìn)行TUNEL原位標(biāo)記。將石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，進(jìn)行凋亡細(xì)胞的原位檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片于400倍光鏡下觀測(cè)，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡陽(yáng)性細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1ABR檢測(cè) 各組動(dòng)物用藥前后ABR閾值及Ⅰ波潛伏期見(jiàn)表1，2。對(duì)照組用藥前后ABR閾值及Ⅰ波潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；順鉑組用藥后Ⅰ波潛伏期、ABR閾值較用藥前明顯升高，自身前后對(duì)照，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明順鉑造成了明顯的耳蝸毒性，動(dòng)物模型制作成功；順鉑加川芎嗪組用藥后Ⅰ波潛伏期、ABR閾值與順鉑組相比較差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 三組動(dòng)物ABR閾值變化情況

注：與對(duì)照組比較，★P<0.01；與順鉑組比較，*P<0.01；與對(duì)照組比較，△P<0.05。

表2 三組動(dòng)物ABRN1波潛伏期變化情況

注：與對(duì)照組比較，★P<0.01；與順鉑組比較，*P<0.05。

2.2耳蝸基底膜鋪片及琥珀酸脫氫酶(SDH)染色 光鏡下觀察耳蝸底回基底膜鋪片情況：正常豚鼠耳蝸基底膜鋪片毛細(xì)胞SDH染色呈深紫藍(lán)色，顯色分布均勻，毛細(xì)胞排列整齊,各回均有排列整齊的3排外毛細(xì)胞和1排內(nèi)毛細(xì)胞，毛細(xì)胞自然損失率極少，顯示SDH活性正常(圖1)；順鉑組豚鼠耳蝸毛細(xì)胞SDH可見(jiàn)明顯的染色變淡或消失，毛細(xì)胞的SDH活性受到抑制，尤以外毛細(xì)胞明顯而內(nèi)毛細(xì)胞變化較輕，外毛細(xì)胞明顯受損(圖2)；中藥組毛細(xì)胞損傷及SDH變化明顯輕于順鉑組(圖3)。

圖1 對(duì)照組耳蝸基底膜SDH染色鋪片(×400)(IHC為外毛細(xì)胞，OHC為內(nèi)毛細(xì)胞)

圖2 順鉑組耳蝸毛細(xì)胞琥珀酸脫氫酶染色鋪片(×400)

圖3中藥組耳蝸毛細(xì)胞琥珀酸脫氫酶染色鋪片(×400)

2.3毛細(xì)胞TUNEL檢測(cè)

光鏡下觀察，對(duì)照組中，很少發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，僅偶爾見(jiàn)底回螺旋神經(jīng)節(jié)和Corti氏器有個(gè)別陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)(圖4)；順鉑組各回均出現(xiàn)被染成棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞，以底回Corti氏器中最多，第二回其次，三四回較少(圖5)；毛細(xì)胞排列紊亂，有缺失；中藥組底回Corti氏器中毛細(xì)胞排列規(guī)則，無(wú)缺失；也有TUNEL陽(yáng)性毛細(xì)胞出現(xiàn)，但數(shù)量與順鉑組比較明顯較少(圖6)。

圖4 對(duì)照組耳蝸底回Corti器TUNEL染色(×400)

圖5 順鉑組耳蝸底回Corti器TUNEL染色(×400)(箭頭所指即TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞)

圖6 中藥組耳蝸底回Corti器TUNEL染色(×400)

3 討 論

順鉑是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥物之一，普遍用于頭頸部及泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的治療；因其具有嚴(yán)重的耳毒性、腎毒性等副作用，致使其臨床應(yīng)用受到一定的限制。因此減輕順鉑的副作用特別是其耳、腎毒性一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前臨床上對(duì)使用順鉑的腫瘤患者通過(guò)水化及同時(shí)給予藥物利尿等措施已可以大大減輕順鉑的腎毒性，故對(duì)順鉑耳毒性的防治研究已成為一亟需解決的課題，具有重要的臨床意義。

順鉑耳毒性主要表現(xiàn)為耳鳴和耳聾，二者可同時(shí)或單獨(dú)出現(xiàn)。耳鳴的發(fā)生率約為2%～36%，耳聾的發(fā)生率約為7%～91%。耳聾通常為雙側(cè)，以高頻聽(tīng)力損害最為明顯，隨著用藥劑量的增加，聽(tīng)力損失會(huì)逐漸向低頻區(qū)發(fā)展并可波及語(yǔ)言頻率，癥狀輕者停藥后可恢復(fù)，重者聽(tīng)力永久喪失[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑組用藥后ABR反應(yīng)閾值及I波潛伏期明顯延長(zhǎng)，高頻區(qū)聽(tīng)力受損，證實(shí)順鉑耳毒性模型制備成功；耳蝸鋪片顯示應(yīng)用順鉑后毛細(xì)胞受到損傷，且越靠近底回毛細(xì)胞受損越嚴(yán)重，表現(xiàn)為毛細(xì)胞紊亂、倒伏、缺失，其中外毛細(xì)胞較內(nèi)毛細(xì)胞損傷較早且嚴(yán)重，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說(shuō)明毛細(xì)胞是順鉑耳毒性的主要靶細(xì)胞之一[7]。實(shí)驗(yàn)中順鉑加川芎嗪組ABR閾值雖有升高但明顯輕于順鉑組，耳蝸鋪片顯示毛細(xì)胞損傷也明顯輕于順鉑組，說(shuō)明川芎嗪能有效的保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)及功能，減輕順鉑所致的聽(tīng)覺(jué)損害。

目前，關(guān)于順鉑耳毒性的機(jī)制有很多學(xué)說(shuō)，其中自由基增多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷學(xué)說(shuō)及細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)已被大多數(shù)人認(rèn)同[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TUNEL檢測(cè)顯示順鉑組豚鼠耳蝸內(nèi)凋亡的毛細(xì)胞數(shù)量明顯增多，證實(shí)凋亡參與了順鉑的耳毒性過(guò)程。毛細(xì)胞SDH染色結(jié)果顯示順鉑組SDH明顯減弱，SDH是細(xì)胞線粒體的標(biāo)志酶，提示順鉑可以導(dǎo)致毛細(xì)胞能量代謝障礙，從而進(jìn)一步引起毛細(xì)胞損傷[8]。由于順鉑耳毒性的確切機(jī)制目前仍不明確，因此臨床上還沒(méi)有一種方法能有效的對(duì)抗順鉑耳毒性。近年來(lái)，我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥有了較快發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)活血化瘀類藥物具有豐富的藥理作用。川芎嗪是常用的活血化瘀類中藥之一，研究表明其具有活血化瘀、清除自由基、抗氧化等多種藥理學(xué)作用，并且已經(jīng)用于聽(tīng)覺(jué)疾病的治療[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用川芎嗪后SDH染色變化較小，毛細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯少于順鉑組，進(jìn)一步說(shuō)明川芎嗪能夠保護(hù)順鉑所致的耳蝸損傷。其具體機(jī)制可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)：①川芎嗪能改善順鉑中毒耳蝸血管紋的微循環(huán)狀況，減輕CDDP對(duì)血管紋的損傷；使聽(tīng)神經(jīng)正常活動(dòng)所需的內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境能保持相對(duì)恒定。②川芎嗪還能有效清除自由基，減輕自由基對(duì)耳蝸內(nèi)生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，使耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)線粒體膜和溶酶體膜免遭破壞，保護(hù)了SDH活性，使毛細(xì)胞代謝功能和形態(tài)基本正常。③川芎嗪可以通過(guò)對(duì)抗毛細(xì)胞的凋亡保護(hù)耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)及功能。

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