董 敏,席剛明,張正洪

(鄖陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北十堰 442000)

PEP-1-SOD1預處理對腦梗死后小鼠海馬神經(jīng)元的保護*

董 敏#,席剛明△,張正洪

(鄖陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北十堰 442000)

目的研究PEP-1-銅,鋅超氧化物歧化酶(PEP-1-SOD1)預處理對腦梗死后小鼠海馬神經(jīng)元的保護作用。方法健康雄性成年昆明小鼠隨機分為假手術組、模型組以及PEP-1-SOD1預處理組。線栓法制作永久性大腦中動脈閉塞(PMCAO)模型。假手術組以及模型組在手術前30 min腹腔注射生理鹽水200 μ L,PEP-1-SOD1預處理組手術前30 min注射PEP-1-SOD1 200 μ g。手術后24 h分離梗死側(cè)海馬組織,TUNEL染色測定細胞凋亡,黃嘌呤氧化酶法測定SOD1活性,TBA法測定丙二醛(MDA)含量。結(jié)果手術后24 h與模型組相比,PEP-1-SOD1預處理組凋亡細胞數(shù)量明顯減少(P＜0.01),SOD1活性升高,MDA含量下降(P＜0.05)。結(jié)論PEP-1-SOD1預處理可以有效減輕小鼠腦梗死后海馬神經(jīng)元損傷。

PEP-1-SOD1;腦梗死;保護作用

銅,鋅超氧化物歧化酶(SOD1)是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑,廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、缺血等一系列病理過程,對神經(jīng)元具有保護作用[1]。病理狀態(tài)下,內(nèi)源性SOD1無法清除短時間內(nèi)大量產(chǎn)生的氧自由基;而外源性SOD1分子量過大,不能自由通過血腦屏障,應用受到限制。PEP-1-銅,鋅超氧化物歧化酶(PEP-1-Cu,Zn-superoxide dismutase,PEP-1-SOD1)是一種利用基因工程技術合成的融合蛋白,與單純SOD1相比,其穿透生物膜或者血腦屏障的能力得到很大程度的提高[2-3],為利用SOD1治療與氧自由基產(chǎn)生過多的疾病提供了新的途徑。腦組織血液循環(huán)中斷后,大量自由基產(chǎn)生,細胞出現(xiàn)結(jié)構破壞、功能障礙。因此,清除自由基是腦梗死的有效治療靶點之一。作者前期的研究已經(jīng)證實PEP-1-SOD1可以成功轉(zhuǎn)導入永久性大腦中動脈閉塞后的小鼠海馬組織[4],但其對腦梗死是否具有保護作用,目前沒有報道。本實驗制作小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型,探索PEP-1-SOD1預處理是否可以減輕海馬神經(jīng)元缺血損傷,為利用PEP-1-SOD1治療腦梗死等與氧化應激相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 SOD1活性測定試劑盒,MDA檢測試劑盒(建成生物工程研究所,南京);一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Beyotime Biotechnology公司,江蘇);4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-Diamidino-2-phenylinole,DAPI)(Sigma化學公司,美國);PEP-1-SOD1蛋白(鄖陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院臨床研究所,十堰),紫外分光光度計(CE 2041,北京),恒冷箱冰凍切片機(Leica CM1900,德國),倒置熒光顯微鏡(Nikon,日本)。

1.2 實驗動物與分組 健康雄性成年昆明小鼠,由鄖陽醫(yī)學院實驗動物中心提供,體質(zhì)量 35～40 g,自然光線下飼養(yǎng) 1周以適應環(huán)境。動物自由食水,維持室溫25℃,相對濕度60%。小鼠隨機分為假手術組、模型組及PEP-1-SOD1預處理組。假手術組及模型組在手術前30 min腹腔注射生理鹽水200 μ L,PEP-1-SOD1預處理組手術前30 min注射 PEP-1-SOD1 200 μ g。

1.3 小鼠永久性大腦中動脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion,PMCAO)模型的制作 小鼠稱重后腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg),頸部正中切口,暴露右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈,枕動脈以及翼腭動脈,分離并結(jié)扎頸外動脈起始部及頸總動脈近心端,頸總動脈分叉套線備用;在距離分叉處約2 mm左右剪一小口,插入標記好的,用硅膠處理過的頭端光滑,直徑約0.104 mm的線栓,深度約(10.88±0.61)mm,稍有阻力即止。結(jié)扎套線,剪除多余線栓,縫合切口并再次消毒[5]。假手術組除不插線外,余操作同上。動物清醒后按8級行為評分法進行神經(jīng)功能缺損評分[6]:0級為無神經(jīng)缺失癥狀;1級為左前爪不能完全伸展;2級為輕微向后牽拉鼠尾并將后肢提起,左前爪抓力明顯減低;3級為運動自如,但牽拉鼠尾時會向左側(cè)傾斜或轉(zhuǎn)圈;4級為向左側(cè)傾斜或劃圈運動;5級為刺激后運動;6級為刺激無運動,伴有意識障礙;7級為死亡;以上0～7級分別為 0～7分。本研究選取 1～6分者作為成功模型繼續(xù)下一步實驗,并經(jīng)T TC染色證實右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)腦組織有明確的梗死灶。

1.4 T UNEL染色 手術后24 h,每組各取造模成功的小鼠5只,麻醉后迅速開胸,升主動脈置管,預冷0.1 M PBS灌流至肝臟發(fā)白,4%多聚甲醛繼續(xù)灌注約150 mL,再以同樣試劑后固定4 h,流水漂洗過夜,梯度蔗糖(5%、10%、15%、20%、25%以及30%)脫水,用冰凍切片機作連續(xù)腦冠狀切片(片厚6 μ m)。用含0.1%Triton的0.01 M PBS洗滌10 min×2次,按一步法TUNEL試劑盒說明配置檢測液,37℃避光孵育60 min,于最后15 min加入DAPI染色。0.01 M PBS漂洗 10 min×3次,甘油封片后用倒置熒光顯微鏡照相。每組5張切片,每張切片隨機取右側(cè)海馬區(qū)5個互不重疊的視野,圖片輸入計算機,Image Pro Plus軟件計算特異性染色陽性細胞百分比。

1.5 SOD1活性以及丙二酫(malondialdehyde peroxidase,MDA)含量檢測 手術后24 h,每組各取造模成功的小鼠5只,深度麻醉后斷頭取腦,冰盤中分離海馬組織,預冷0.1 M PBS漂洗,稱重后按1∶9質(zhì)量容積比加入 0.1 M PBS,制成10%勻漿,以牛血清清蛋白(1 mg/mL)作為對照,采用Bradford法測定蛋白含量,依據(jù)試劑盒說明用黃嘌呤氧化酶法測定SOD1活性,TBA法測定MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1 細胞凋亡 熒光顯微鏡下觀察DAPI標記細胞核為藍色,凋亡細胞發(fā)出特異性綠色熒光,二者重疊后為青色。假手術組凋亡細胞較少,約為(1.50±0.35)%,模型組凋亡細胞明顯增多,達(49.98±5.08)%,給予PEP-1-SOD1預處理后凋亡細胞的數(shù)量明顯減少,約為(32.72±4.01)%,與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),見彩插Ⅰ圖 1。

圖2 SOD1活性及MDA含量

2.2 SOD1活性以及MDA含量 手術后24 h,假手術組海馬組織SOD1活性為(60.06±3.26)U/mgprot,模型組為(50.02±1.40)U/mgprot,與假手術組相比明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);PEP-1-SOD1預處理后SOD1活性為(55.99±3.59)U/mgprot,高于模型組,二者相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。手術后24 h,假手術組MDA含量為(8.06±0.94)nmol/mgprot,模型組為(10.83±1.79)nmol/mgprot,與假手術組相比明顯升高(P＜0.01);PEP-1-SOD1預處理組MDA含量為(8.32±0.98)nmol/mgprot,與假手術組相比差異無統(tǒng)計學意義,但與模型組相比明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖 2。

3 討 論

作為有機體重要的氧自由基清除劑,多年來人們一直在探索利用外源性SOD1治療與氧化應激有關的疾病。但其屬于大分子物質(zhì),在體內(nèi)沒有相應的受體和通道,也不能通過內(nèi)吞作用等入胞方式進入細胞內(nèi),因此應用受到限制[7]。通過與細胞穿透肽——PEP-1進行融合,外源性SOD1的轉(zhuǎn)導能力得到提高[8]。作者前期的研究已經(jīng)證實PEP-1-SOD1可以成功進入小鼠海馬組織并表現(xiàn)出一定的時間依賴性,轉(zhuǎn)導后酶的活性可維持24 h以上[4],為進一步觀察PEP-1-SOD1對海馬神經(jīng)元的保護作用提供了實驗基礎。

腦組織血液循環(huán)中斷后大量氧自由基產(chǎn)生,細胞結(jié)構破壞,功能受損,海馬組織對缺血尤為敏感[9]。大量研究已經(jīng)證實清除氧自由基是減輕缺血損傷的有效途徑之一[10-11]。為探索PEP-1-SOD1對海馬神經(jīng)元的保護作用,本研究用線栓法建立小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型,并在手術前30 min腹腔注射200 μ g PEP-1-SOD1。研究結(jié)果顯示模型組海馬組織在腦梗死后24 h出現(xiàn)大量凋亡神經(jīng)元,而PEP-1-SOD1組凋亡神經(jīng)元則明顯減少。EUM等[12]的研究顯示短暫性腦缺血手術前或手術后腹腔注射PEP-1-SOD1可有效提高海馬區(qū)神經(jīng)元存活率,與本研究結(jié)果相似。

為進一步研究PEP-1-SOD1保護神經(jīng)元的途徑,本文對SOD1活性以及MDA含量也進行了檢測。研究結(jié)果顯示與模型組相比,PEP-1-SOD1預處理可使SOD1活性維持于較高水平,從而提高其清除氧自由基的能力[13]。MDA是脂質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物,通過測定其水平可以反映機體脂質(zhì)過氧化程度。PEP-1-SOD1預處理可以減輕脂質(zhì)過氧化,降低MDA含量,從另一方面反映了其對神經(jīng)元的保護效應。

總的來說,本研究證實PEP-1-SOD1可以有效減輕腦梗死后海馬神經(jīng)元損傷,為利用其治療與氧自由基產(chǎn)生過多有關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實驗依據(jù)。值得注意的是這一保護效應是在單次腹腔注藥的情況下取得的,其長期用藥效果如何,有待進一步研究。

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Neuropretection of PEP-1-S OD1 fusion protein against cerebral infarction in murine hippocampal region*

DONG Min#,XI Gang-ming△,ZHANGZheng-hong
(Department of Neurology,The Af f iliated Renmin Hospital of Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

ObjectiveTo explore the neuropretection of PEP-1-SOD1 against the cerebral infarction in murine hippocampal region.MethodsThe mice were assigned randomly into sham-operated group,model group and PEP-1-SOD1 pre-treatment group,the model of permanent middle cerebral artery occlusion(PM CAO)was set up.The mice were intraperitoneally injected 200 μ L saline in sham-operated group and model group or 200μ g PEP-1-SOD1 in PEP-1-SOD1 pre-treatment group 30 min before operation,respectively.After 24 h of surgery,the animals were sacrificed and the hippocampal tissues were dissected for TUNEL stained,SOD1 activity and MDA amount.ResultsAfter 24 h of surgery,compared with model group,the apoptotic cells in PEP-1-SOD1 pre-treatment group were ameliorated(P＜0.01),the activity of SOD1 was increased and the amount of MDA was decreased(P＜0.05).ConclusionPretreatment with PEP-1-SOD1 fusion protein can attenuate the neurons damage resulted from the cerebral infarction.

PEP-1-SOD1;cerebral infarction;protection

R743.33;R-332

A

1671-8348(2010)12-1487-02

湖北省高等學?？茖W研究青年發(fā)展項目(98B042)?！? class="emphasis_bold">通訊作者,

,E-mail:xgmsys@21cn.com。#現(xiàn)湖北省襄樊市中醫(yī)院麻醉科工作。

2009-07-27

2009-11-17)

圖1 24 h后凋亡海馬神經(jīng)元(×400)

·經(jīng)驗交流·