張俊杰,張立堅,劉春安,張良滔,蔡 春

(廣東醫(yī)學(xué)院,廣東 湛江 524023)

組織中全基因組DNA甲基化的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

張俊杰,張立堅,劉春安,張良滔,蔡 春

(廣東醫(yī)學(xué)院,廣東 湛江 524023)

建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定組織中全基因組DNA甲基化水平的方法。采用苯酚氯仿提取組織DNA,提取的DNA用88%甲酸在140℃下裂解,DNA裂解液加入同位素胞嘧啶作內(nèi)標,經(jīng)N2吹干后,用甲醇溶解,以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的含量,并計算全基因組中DNA甲基化的水平。結(jié)果表明,胞嘧啶的線性范圍為1～100μg·L-1,相關(guān)系數(shù)為0.997 4,相對標準偏差為0.70%～4.09%;5-甲基胞嘧啶的線性范圍為1～50μg·L-1,相關(guān)系數(shù)為0.994 8,相對標準偏差為0.60%～4.81%。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的檢出限為1 pg,日內(nèi)相對標準偏差為1.86%～4.67%,日間相對標準偏差為3.72%～4.68%,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的加樣回收率為86.52%～105.14%。本研究所建立的方法檢測組織中DNA甲基化程度,具有專一性強、操作簡便的優(yōu)點,能較好的滿足全基因組DNA甲基化檢測的要求。

DNA甲基化;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS);胞嘧啶;5-甲基胞嘧啶

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo),在堿基上結(jié)合一個甲基的化學(xué)修飾過程。高等生物中的甲基化以胞嘧啶5位甲基化為主。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,它是有核細胞特有的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄后修飾,能夠在不改變基因組中堿基排序的情況下影響基因轉(zhuǎn)錄和表達,它涉及到個體發(fā)育,細胞增殖、分化、基因印跡、X染色體失活,基因表達調(diào)控和堿基突變等多方面的生物學(xué)功能[1-4],特別對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的生物學(xué)意義。腫瘤中DNA甲基化模式發(fā)生改變,表現(xiàn)為全基因組低甲基化和某些基因啟動子Cp G島區(qū)的高甲基化。這種甲基化模式的改變與腫瘤變化的關(guān)系已成為腫瘤研究的一個熱點。

DNA甲基化的準確檢測對于研究DNA甲基化變化極為重要。有文獻[5-7]報道,DNA經(jīng)酶解后,運用LC-M S/M S技術(shù)檢測5′-甲基胞嘧啶核苷和胞嘧啶核苷的含量,從而計算DNA甲基化程度。此外,也有文獻[8]報道,DNA通過化學(xué)方法裂解后,采用 GC/MS方法進行5′-甲基胞嘧啶和胞嘧啶含量的檢測。本工作使用化學(xué)方法將DNA裂解后,運用LC-M S/M S法測定5′-甲基胞嘧啶和胞嘧啶的含量,評價DNA的甲基化程度,并用所建立的方法分析6例結(jié)腸癌病人腫瘤組織和正常結(jié)腸組織中全基因組DNA甲基化的變化。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

3K15臺式高速冷凍離心機:德國Sigma公司產(chǎn)品;UV-2100型紫外可見分光光度計:上海元析儀器有限公司產(chǎn)品;Aglient 1200-6430A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國安捷倫公司產(chǎn)品。

胞嘧啶(cytosine,Cyt)和5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m Cyt):購于 Sigma公司;同位素胞嘧啶(cytosine-13C15N2):購于 Toronto research chemicals inc.。

氯仿,異戊醇,十二烷基磺酸鈉(SDS),無水乙醇,甲酸,乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)和鹽酸(HCl)均為分析純;乙腈 (色譜純)/甲酸胺和甲酸(色譜純);實驗用水為M illi-Q超純水;三羥甲基胺基甲烷(Tris)和 Tris飽和酚為生化試劑。

1.2 儲備液和工作液的配制

1.2.1 儲備液的配制 準確稱取10 mg Cyt和5mCyt,用甲醇溶解定容至250 m L,得40 mg·L-1Cyt和 5m Cyt標準儲備液;取 10 mg Cyt13C15N2內(nèi)標物,用甲醇溶解后,置于250 mL容量瓶中,定容至刻度,得 40 mg·L-1Cyt13C15N2標準儲備液。所有儲備液在-20℃冰箱保存,待用。

1.2.2 工作液的配制 臨用時取Cyt儲備液,加入甲醇 ,稀釋成濃度為 100、75、50、40、25、10、7.5、5、2.5和 1μg·L-1工作液;取 5mCyt儲備液 ,加入甲醇 ,稀釋成濃度為 50、40、25、10、7.5、5、4、2.5、1和 0.5μg·L-1工作液;臨用時取 40 mg·L-1的Cyt13C15N2標準儲備液,加入甲醇,稀釋成濃度為40μg·L-1的Cyt13C15N2內(nèi)標工作液。

1.3 樣品處理

取結(jié)腸癌病人手術(shù)后的少量腫瘤組織和腫瘤旁正常結(jié)腸粘膜組織,置于-70℃冰箱保存。

1.3.1 DNA提取 取 0.05 mg組織,加入0.12 mL蛋白酶 K(20 g·L-1)、4 mL Tris-HCl-EDTA(TE)緩沖液和0.48 m L 10%SDS,45℃水浴過夜,加入V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1進行提取,搖勻6 000×g離心 5 min,取上清,重復(fù)提取 1次;再加入V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1,搖勻 6 000×g離心5 min;取上清加入1/10倍體積的3 mol·L-1醋酸鈉和2.5倍的無水乙醇,12 000×g離心5 m in,倒去溶液,加入1 m L TE緩沖液溶解。用紫外可見分光光度計檢測 DNA純度,當A260nm/A280nm=1.7～1.9時,視為純DNA。若有RNA污染加入RNase A,重復(fù)以上步驟。

1.3.2 DNA裂解 取約2.5μg DNA放入反應(yīng)瓶中,用 N2吹干,然后加入0.2 mL 88%甲酸,140℃反應(yīng)90 min,待其冷卻至室溫后,用N2吹干,加入400μL甲醇溶解,15 000×g離心4 min,取上清液,LC/M S分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件 BEH H IL IC色譜柱(1.7μm×2.1 m×100 mm,Waters公司產(chǎn)品);流動相:A為0.1%甲酸銨,B為乙腈;流速:0.4 m L·min-1;柱溫為室溫,進樣量5μL;洗脫程序:0～1 min A為10%,1～2 min A從10%變?yōu)?50%,2～2.5 min A為 50%,2.5～8 m in A從50%變?yōu)?0%。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧正離子電離模式,離子源溫度300℃;噴霧電壓3.5 kV,噴霧氣流量9 L·min-1;入口電壓:Cyt和5m Cyt為114 V,Cyt13C15N為115 V。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測;碰撞能量:Cyt和5mCyt為20 V,Cyt13C15N為16 V。Cyt定量離子m/z112/95,輔助定量離子m/z69;5m Cyt定量離子m/z126/109,輔助定量離子m/z83;Cyt13C15N定量離子m/z115/97,輔助定量離子m/z115/70。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用內(nèi)標法定量,以w(5mCyt)/[w(5mCyt)+w(Cyt)]×100%的方式表示DNA甲基化程度,Excell進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 5mCyt和Cyt質(zhì)譜圖

分別加入5μL 1 mg·L-1Cyt、40μg·L-1Cyt13C15N2和 1 mg·L-15mCyt標準溶液,經(jīng)LC-M S/M S分析,其質(zhì)譜圖示于圖1。圖1中,m/z112([M+H]+)、m/z115([M+H]+)和m/z126([M+H]+)分別為 Cyt、Cyt13C15N2和5m Cyt分子離子峰;m/z112/95和m/z126/109分別為Cyt和5mCyt的主要碎片離子,因此選用m/z112/95和126/109作為Cyt和5m Cyt的定量檢測。

圖1 Cyt(a)、Cyt13 C15 N2(b)和5mCyt(c)的子離子圖Fig.1 Product ion scan of Cyt(a),Cyt13 C15 N(b)and 5mCyt(c)

2.2 Cyt和5mCyt色譜條件

實驗中所需分離的嘧啶為堿性物質(zhì),因此采用適合于低p H值流動相的 H IL IC柱,對甲酸銨-乙腈、乙腈-甲酸溶液等多種流動相進行實驗。結(jié)果表明,以乙腈-0.1%甲酸銨溶液為流動相,流速0.4 m L·min-1;洗脫條件:0～1 min A為10%,1～2 m in A從 10%變?yōu)?50%,2～2.5 min A為50%,2.5～8 min A從50%變?yōu)?0%時得到的峰形最好,示于圖2。

圖2 標準品Cyt(a),Cyt13 C15 N2(b)和5mCyt(c)的M RM圖Fig.2 M RM of Cyt(a),Cyt13 C15 N2(b)and 5mCyt(c)in standard solution

2.3 線性范圍及精密度實驗

混合標準液包括5mCyt和Cyt,其中質(zhì)量濃度系列為 0.5、1、2.5、4、5、7.5、10、25、40 和 50 μg·L-1,Cyt質(zhì)量濃度系列為 1、2.5、4、5、7.5、10、25、40、50、75 和 100 μg·L-1,加 入40μg·L-1Cyt13C15N2作內(nèi)標,進樣 5次。分別以Cyt和5m Cyt質(zhì)量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線,并以信噪比為3確定樣品的最低檢測限。結(jié)果表明,Cyt和5m Cyt的檢出限為 1 pg,Cyt的線性范圍為 1～100 μg·L-1,標準曲線為y=1.258 0x-0.625 5,相關(guān)系數(shù)R2為0.997 4,相對標準偏差 RSD為0.70%～4.09%;5mCyt的線性范圍為1～50 μg·L-1,標準曲線為y=1 216.621 2x-593.699 8,相關(guān)系數(shù)R2為0.994 8,相對標準偏差RSD為0.60%～4.81%。

2.4 重現(xiàn)性實驗

取同一樣品,按 1.3方法制備 3份,測定Cyt和5mCyt兩個色譜峰相對豐度的RSD列于表1。

表1 定量測定結(jié)腸癌組織中Cyt和5m Cyt的重現(xiàn)性Table 1 Reproducibility of Cyt and 5mCyt in colon cancer

2.5 穩(wěn)定性實驗

取同一DNA樣品試液,在-20℃分別保存2、4、6、8、10 h 后 ,測定 Cyt和 5mCyt兩個定量質(zhì)譜峰相對豐度的 RSD分別為1.86%和4.67%。

取同一DNA樣品試液,在-20℃分別保存1、2、3、4、5 d 后 ,測定 Cyt和 5mCyt兩個定量質(zhì)譜峰相對豐度的RSD分別為3.72%和4.68%。

2.6 回收率實驗

取同一結(jié)腸癌病人的腫瘤DNA溶液,經(jīng)88%甲酸在140℃下裂解后,分別加入400μL 50、10、1和 0μg·L-1的 Cyt和 5m Cyt,N2吹干,加入甲醇溶解,15 000 r·min-1離心5 min,取上清液,用于LC/M S分析。測定Cyt回收率分別為87.38%、105.14%和96.18%;5m Cyt回收率分別為89.58%、86.52%和94.52%,其結(jié)果列于表2。

2.7 結(jié)腸癌組織樣品分析

利用上述方法檢測了6例結(jié)腸癌組織中DNA甲基化水平,結(jié)腸癌患者正常組織和腫瘤組織甲基化分析結(jié)果列于表3。實驗結(jié)果表明,癌組織的甲基化水平低于相應(yīng)的正常組織,這與文獻[9]報道一致,說明本方法可以很好地用于全基因組DNA甲基化水平的檢測。

表2 樣品添加回收率實驗(n=3)Table 2 Recoveries of Cyt and 5m Cyt from spiked sam ples(n=3)

表3 結(jié)腸癌和正常組織樣品甲基化分析結(jié)果Table 3 Results of contents in colon cancer tissuesand normal tissues

3 討論

目前檢測基因組DNA甲基化主要有SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法和測序法,其中SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法由于SAM和SssI甲基轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)不穩(wěn)定,易造成實驗結(jié)果誤差比較大,必須設(shè)立自身對照來標化實驗數(shù)據(jù);測序法需要大量的克隆測序,較為繁瑣[10]。最近報道[11-13],LC-M S/M S測定嘧啶核苷,此方法需要核酸酶、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶等酶水解DNA,由于酶活性的影響可能存在由于酶解不完全帶來的誤差。另有報道[8]將DNA用化學(xué)方法裂解為嘧啶后,通過衍生用GC/M S測定甲基化胞嘧啶和胞嘧啶的含量,該方法中嘧啶的衍生增加了操作的難度。本方法通過化學(xué)裂解DNA,既排除酶解法可能帶來的誤差,又不需要衍生,大大簡化了操作。

胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶在C 18柱上沒有保留,改變洗脫溶劑也無法解決,改用適合堿性化合物分析的 H IL IC柱后,胞嘧啶和5-甲基嘧啶實現(xiàn)了分離,并發(fā)現(xiàn) H IL IC柱比C 18柱的靈敏度高,這可能與 H IL IC柱使用高比例有機相有關(guān)。

用乙腈和0.1%甲酸作為流動相時,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶在柱上的保留時間基本相同;當用p H 4.5～6的乙酸-乙酸銨緩沖液作流動相時,色譜峰發(fā)生分岔的現(xiàn)象;而用p H 3.6的乙酸-乙酸銨緩沖液作為流動相,色譜峰沒有分岔,但是重現(xiàn)性不好,提示p H值和緩沖體系對胞嘧啶和5-甲基-胞嘧啶的分析影響比較大;當改用乙腈和0.1%甲酸銨水溶液作流動相時,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶基本分離,且重現(xiàn)性較好。

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Analysis of Global DNA Methylation in Tissue by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Jun-jie,ZHANG Li-jian,L IU Chun-an,ZHANG Liang-tao,CA IChun
(Guangdong M ed ical College,Zhanjiang 524023,China)

Global DNA methylation in tissue was determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-M S/M S).DNA w as extracted by phenol-chlo roform,hydrolyzed using 88%formic acid at 140 ℃,spiked with cytosine-2,4-13C2,15N2as internal standard,reconstituted in methanol and analyzed by LC-M S/M Swith multip le reaction monitoring mode,to reflect the global DNA methylation level of the tissue.Results show that the limit of quantification is 1μg·L-1for both Cytosine(Cyt)and 5-methylcytosine(5m Cyt),and the linear rangesof calibration curve are 1—50μg·L-1and 1—100μg·L-1for 5mCyt and Cyt,respectively,with correlation coefficient higher than 0.99.The relative standard deviations(RSDs)are 0.70%—4.09%and 0.60%—4.81%for Cyt and 5mCyt,respectively.The intra-day precision exp ressed as RSD ranges from 1.86%to 4.67%,while the inter-day values f rom 3.72%to 4.68%.The recovery ratio of method varies from 86.52%to 105.14%.The method is simple,and can be used for detection of Cyt and 5mCyt,thus enabling the evaluation of global DNA methylation.

DNA methylation;liquid chromatography-tandem mass spectrum(LC-MS/M S);cytosine;5-methylcytosine

O 657.63

A

1004-2997(2010)06-0326-05

2010-06-30;

2010-09-29

張俊杰(1985～),男(漢族),廣東東莞人,碩士研究生,藥物分析與儀器分析專業(yè)。E-mail:zhjunjie357753@163.com

蔡 春(1961～),男(漢族),廣東湛江人,教授,從事生物醫(yī)學(xué)分析研究。E-mail:caichun@gdmc.edu.cn