陳麗娜,宋鳳瑞,劉志強(qiáng)

(1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所,長(zhǎng)春質(zhì)譜中心,吉林長(zhǎng)春 130022;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用進(jìn)展

陳麗娜1,2,宋鳳瑞1,劉志強(qiáng)1

(1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所,長(zhǎng)春質(zhì)譜中心,吉林長(zhǎng)春 130022;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京 100049)

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-M S/MS)技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域的研究已經(jīng)顯示出極大的發(fā)展?jié)摿?。本文闡述LC-MS/MS法在農(nóng)殘分析中的研究進(jìn)展,特別強(qiáng)調(diào)了該技術(shù)在中藥農(nóng)殘分析中的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景。由于樣品前處理是農(nóng)殘分析中耗時(shí)最多、最易引起誤差的關(guān)鍵環(huán)節(jié),本文也討論了最近發(fā)展和廣泛應(yīng)用的前處理技術(shù),分析了不同方法的特點(diǎn),從而為我國(guó)中藥行業(yè)在農(nóng)藥殘留方面的監(jiān)測(cè)工作提供參考。

中藥材;農(nóng)藥殘留;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS);前處理

農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥使用后殘存于生物體,農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。農(nóng)藥的發(fā)明和使用在提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時(shí),也帶來(lái)了很多負(fù)面作用。

中藥由于療效確切、副作用小,越來(lái)越受到人們的青睞。但由于我國(guó)在制定植物藥農(nóng)殘檢驗(yàn)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面起步較晚,嚴(yán)重制約了對(duì)農(nóng)藥殘留的有效監(jiān)控。而許多國(guó)家都增加了農(nóng)殘檢驗(yàn)項(xiàng)目,特別是歐美發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)藥用植物的農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)一般是參照食品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的,對(duì)中藥農(nóng)藥殘留限量提出了較高的要求。由于缺少與國(guó)際接軌的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),常使得我國(guó)在中藥材貿(mào)易中處于不利地位。因此,建立一種準(zhǔn)確、靈敏、可靠的中藥農(nóng)藥殘留分析方法十分迫切。

目前,我國(guó)在中藥農(nóng)殘檢測(cè)方面仍以氣相色譜(GC)為主,液相色譜(LC)由于靈敏度低應(yīng)用相對(duì)較少。而在世界范圍內(nèi),色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已成為主導(dǎo)檢測(cè)技術(shù),并實(shí)現(xiàn)了一次進(jìn)樣分析上百種農(nóng)藥,極大減少了分析時(shí)間,降低了檢測(cè)費(fèi)用。GC/M S和LC-M S/M S是兩種應(yīng)用最多的色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。A lder等[1]對(duì)500種農(nóng)藥的 GC/M S和LC-M S/M S數(shù)據(jù)進(jìn)行考察,通過(guò)比較最低檢測(cè)限、檢測(cè)范圍和選擇性,證明LC-MS/M S比GC/M S具有更好的分析性能和更寬的適用范圍。Hiem stra等[2]也證明M S/M S的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(M RM)是抑制基質(zhì)干擾,顯著提高檢測(cè)器靈敏度和選擇性的主要原因。GC雖然也可以與MS/M S聯(lián)用,但是由于沒(méi)有合適的軟電離源,不能產(chǎn)生足夠強(qiáng)度的分子離子峰,應(yīng)用前景尚不明朗。目前,LC-M S/M S在食品、環(huán)境等領(lǐng)域的農(nóng)殘分析中已得到廣泛應(yīng)用[3-7],并有相關(guān)綜述報(bào)道[8-10]。然而,LC-M S/M S法在中藥農(nóng)殘分析中的報(bào)道卻很少[11-12]。

此外,前處理技術(shù)落后也是制約中藥農(nóng)殘分析方法發(fā)展的重要因素。傳統(tǒng)的提取、凈化方法存在溶劑消耗量大、操作過(guò)程繁瑣、分析周期長(zhǎng)、回收率低等缺點(diǎn),一些其他領(lǐng)域較為先進(jìn)的前處理技術(shù)不能套用進(jìn)來(lái)。Hajou等[13]以兩種AOAC方法為指導(dǎo),分析中藥茴香中有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯等農(nóng)藥,認(rèn)為一般的農(nóng)藥多殘留前處理方法不能無(wú)條件的應(yīng)用于特定中藥,但是兩種以上方法可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。然而,這無(wú)疑又增加了實(shí)驗(yàn)的工作量和成本,與農(nóng)殘分析的發(fā)展趨勢(shì)背道而馳。

本文將論述LC-M S/M S法在農(nóng)殘分析中的優(yōu)勢(shì)和不足,綜述它在中藥農(nóng)殘分析中的應(yīng)用現(xiàn)狀,研究與其聯(lián)用的樣品前處理技術(shù),通過(guò)與環(huán)境、食品等領(lǐng)域的農(nóng)殘分析做對(duì)比,展望LCM S/MS法與各種前處理方法在中藥農(nóng)殘分析中的發(fā)展趨勢(shì)和應(yīng)用前景。

1 前處理方法研究

隨著選擇性好、分辨率高的檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,農(nóng)藥多殘留檢測(cè)工作逐漸簡(jiǎn)化,而前處理過(guò)程成為分析方法的關(guān)鍵。對(duì)于中藥,其成分的特殊性和復(fù)雜性對(duì)前處理的要求更為嚴(yán)格,因此,建立一種最大限度提取目標(biāo)物并把干擾降到最低的樣品前處理技術(shù)是快速、準(zhǔn)確的中藥農(nóng)藥多殘留檢測(cè)體系成立的前提和保障。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)環(huán)境、食品等領(lǐng)域的農(nóng)藥殘留前處理技術(shù)的研究,特別是對(duì)農(nóng)藥多殘留分析方法的研究取得了較大的進(jìn)展[14-49],而這些方法在中藥農(nóng)藥殘留分析方面的應(yīng)用還處于探索階段。

1.1 溶劑提取

溶劑提取(SE)是最常用、最經(jīng)典的有機(jī)物提取方法,具有操作簡(jiǎn)單、不需要特殊的或昂貴的儀器設(shè)備、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。其原理是根據(jù)殘留農(nóng)藥與樣品組分在不同溶劑中的溶解性差異,通過(guò)振蕩、搗碎、回流或超聲等方式將分析物從樣品基質(zhì)中提取出來(lái)。目前多殘留分析常用的提取溶劑有乙腈,丙酮,乙酸乙酯等。

乙腈、丙酮是極性溶劑,與水互溶,在提取過(guò)程中不會(huì)發(fā)生相分離,且具有很好的分散性,可以有效的提取極性和非極性農(nóng)藥。但是丙酮在提取農(nóng)藥時(shí)會(huì)大量提取植物組織中的油脂和色素,使凈化過(guò)程變得復(fù)雜。而乙腈的選擇性則較好,它可以顯著降低對(duì)非極性脂肪、蛋白質(zhì)、鹽、糖等雜質(zhì)的溶解性,對(duì)于酸堿敏感的農(nóng)藥也易于通過(guò)調(diào)節(jié)p H等方法改善回收率[50],此外它與液質(zhì)具有很好的兼容性,特別適合復(fù)雜基質(zhì)中多種農(nóng)藥的提取,目前已被美國(guó)、日本等國(guó)家的農(nóng)殘檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)所采用。乙酸乙酯極性較弱,對(duì)于含糖量高的樣品較為適合[7]。但用液質(zhì)分析前需轉(zhuǎn)換溶劑,不但過(guò)程繁瑣,更會(huì)造成大量的農(nóng)藥損失。M atovská等[5]討論了6種有機(jī)溶劑在農(nóng)藥多殘留分析中的作用,認(rèn)為乙腈是多數(shù)基質(zhì)的最佳提取溶劑。特別是隨著節(jié)能型提取方式和LC-M S/M S檢測(cè)手段的發(fā)展,乙腈的應(yīng)用將會(huì)更為普遍。此外,甲醇[6]、二氯甲烷[51]等也可作為多殘留分析的提取溶劑,但是應(yīng)用范圍相對(duì)較窄。當(dāng)單一溶劑不夠理想時(shí),也可選用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定比例配成混合提取溶劑,以達(dá)到預(yù)期效果[52]。溶劑提取存在著很多缺點(diǎn),如操作繁瑣、有機(jī)溶劑使用量大,既增加成本又易造成污染,給后期處理工作帶來(lái)很多困難,因此建立溶劑消耗少、操作簡(jiǎn)單的微型前處理方法勢(shì)在必行。

1.2 QuEChERS方法

QuEChERS是 Anastassiades等[3]在固相分散提取基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的一種新型前處理方法。它以快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、有效、耐用、安全的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)受到農(nóng)藥殘留分析工作者的高度關(guān)注,已成為農(nóng)藥多殘留快速檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。QuEChERS法最初用于蔬菜和水果的預(yù)處理[4,14-15],其核心為用與水互溶的乙腈溶劑提取農(nóng)藥,再以氯化鈉和具有更強(qiáng)吸水功能的無(wú)水硫酸鎂誘導(dǎo)相分離,從而使農(nóng)藥進(jìn)入乙腈層;然后采用PSA(N-丙基乙二胺)和 GCB(石墨化碳)吸附凈化,去除脂肪酸、有機(jī)酸和色素等雜質(zhì)。該方法特別適用于多類農(nóng)藥的多殘留分析,Lehotay等[4]證實(shí)有超過(guò)200種農(nóng)藥可用該方法進(jìn)行處理。同時(shí),對(duì)此方法稍作修正,可用于分析果蔬、谷物、牛奶、動(dòng)物飼料、橄欖油、煙草,甚至動(dòng)物全血中的藥物殘留[16,53-60]。Leho tay等[16]用含有0.1%乙酸的乙腈提取,使一些不穩(wěn)定的問(wèn)題農(nóng)藥(殺菌丹、滅菌丹、苯氟磺胺、百菌清等)得到了較高的回收率,進(jìn)一步擴(kuò)大了QuEChERS法的應(yīng)用范圍。該方法已在世界各國(guó)得到廣泛應(yīng)用,2006年歐盟委員會(huì)制定了相應(yīng)的SANCO操作指南。此外,縱觀各國(guó)對(duì)QuECh ERS法的應(yīng)用研究不難發(fā)現(xiàn),QuEChERS法主要是與 GC/M S、LC-M S/M S結(jié)合,對(duì)不同基質(zhì)中農(nóng)藥進(jìn)行多殘留分析,因此,它也將隨著 GC/M S、LC/M S及 GC-M S/M S、LC-M S/M S的發(fā)展而在更多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

1.3 儀器提取

樣品前處理技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)傾向于環(huán)境有好和節(jié)約能源,最佳的前處理方法應(yīng)能減少操作時(shí)間和誤差、提高靈敏度,從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定性定量[61]。因此儀器提取將會(huì)成為主要的提取方法。

1.3.1 超臨界流體萃取 超臨界流體萃取(SFE)以超臨界流體為溶劑,利用其特異增加的滲透能力和溶解能力對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行提取分離,具有萃取過(guò)程易于調(diào)節(jié)、萃取效率高、能耗低、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。最常用的超臨界流體是CO2,用于提取非極性和弱極性農(nóng)藥。為了擴(kuò)大應(yīng)用范圍到中等極性或極性農(nóng)藥,通常需要加入極性調(diào)節(jié)劑。Aguilera等[17]比較了純CO2和以甲醇或乙酸乙酯為極性調(diào)節(jié)劑的CO2萃取食品中多種極性農(nóng)藥的能力,證明極性調(diào)節(jié)劑可以明顯改善此類農(nóng)藥的回收率。此外,不同調(diào)節(jié)劑的作用也不同。Rissato等[18]以丙酮和乙腈為調(diào)節(jié)劑,研究了蜂蜜中有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯和擬除蟲(chóng)菊酯4類農(nóng)藥的SFE提取效率,證明乙腈的作用明顯好于丙酮,因此認(rèn)為極性調(diào)節(jié)劑的作用不僅在于改變超臨界流體的極性,而且在于影響其與樣品基質(zhì)的相互作用。

高選擇性是SFE最顯著的優(yōu)點(diǎn)之一,對(duì)于低脂肪的水果、蔬菜可直接對(duì)提取液進(jìn)行檢測(cè);而對(duì)于脂肪含量高或非常復(fù)雜的基質(zhì)則需要額外的凈化步驟。通常有萃取后凈化[18]和在線凈化[19]兩種。萃取后凈化,即對(duì)提取液進(jìn)行純化,雖然凈化效果好,但會(huì)增加提取時(shí)間和有機(jī)溶劑的用量。目前最為關(guān)注的是在線凈化,即在提取的同時(shí)加入吸附劑進(jìn)行凈化。Aguilera等[19]考察了不同吸附劑在大米提取過(guò)程中的凈化作用,證明用氨基吸附劑可以得到滿意的凈化效果。在線凈化在選擇性提取多種農(nóng)藥殘留的過(guò)程中有著很好的應(yīng)用前景,因此對(duì)不同吸附劑與基質(zhì)的相互作用進(jìn)行研究具有重要的意義。

此外,與SFE聯(lián)用的檢測(cè)技術(shù)多數(shù)為氣相色譜結(jié)合不同專屬性檢測(cè)器[18-20],SFE-GC/M S的發(fā)展極為緩慢[21],SFE-LC/M S的應(yīng)用則更少[22]。除了與方法自身因素有關(guān)外,還由于儀器設(shè)備昂貴、接觸機(jī)會(huì)少、經(jīng)驗(yàn)交流不充分所致。因此超臨界流體萃取儀在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的普及是此方法進(jìn)一步發(fā)展的前提。

1.3.2 加速溶劑萃取 加速溶劑萃取(ASE)也稱高壓液相萃取或快速溶劑萃取,是采用常規(guī)溶劑在較高的溫度(50～200℃)和壓力(6.90×106～1.7×106Pa)下對(duì)固體、半固體樣品進(jìn)行萃取的樣品前處理技術(shù)。其突出的優(yōu)點(diǎn)是有機(jī)溶劑用量少、操作自動(dòng)化、提取速度快、回收率高等,可用來(lái)取代索氏提取等傳統(tǒng)的提取方法,已被美國(guó)國(guó)家環(huán)保局選定為環(huán)境樣品中殺蟲(chóng)劑、除草劑以及多氯聯(lián)苯、二噁英等污染物檢測(cè)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法(標(biāo)準(zhǔn)方法編號(hào)EPA 3545)。

影響ASE萃取效率的主要因素是溫度和壓力。高溫可以增加溶劑對(duì)樣品的滲透力,提高萃取效率。高壓既能讓溶劑在高溫下保持液態(tài),又能保證易揮發(fā)性物質(zhì)不揮發(fā),同時(shí)高壓還有利于溶劑快速充滿萃取池,增加對(duì)樣品組織的穿透能力。另一影響因素是靜態(tài)提取時(shí)間,通常取決于樣品的質(zhì)地。此外,ASE還采用沖洗和氮?dú)獯祾呒夹g(shù)減少溶劑損失,通過(guò)加入分散劑來(lái)擴(kuò)大提取溶劑與樣品的接觸面積,減少溶劑使用量。

目前,ASE已經(jīng)用于各類基質(zhì)中農(nóng)藥的提取[23-26],與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用更進(jìn)一步推動(dòng)了此技術(shù)的發(fā)展[24-26]。但是,ASE也有不足之處,如提取能力太強(qiáng)而導(dǎo)致共同提取物增加,從而使凈化過(guò)程變得復(fù)雜;提取過(guò)程的高溫可能導(dǎo)致熱不穩(wěn)定農(nóng)藥降解。總之,對(duì)ASE的探索仍然任重而道遠(yuǎn)。

1.3.3 微波萃取 微波萃取(MAE)是利用微波能強(qiáng)化萃取效率,使殘留農(nóng)藥從樣品機(jī)體中分離出來(lái)的技術(shù)。自1986年美國(guó)科學(xué)家 Ganzler等[62]首次用微波提取土壤中有機(jī)污染物以來(lái),MAE就受到公眾的注意。與其他提取方法相比,微波將能量直接作用于被加熱物質(zhì),顯著地降低了萃取所需的時(shí)間,避免了長(zhǎng)時(shí)間高溫引起的物質(zhì)分解,因此特別適用于處理熱敏性組分。同時(shí),它對(duì)體系中的不同組分進(jìn)行選擇性加熱,成為一種能使目標(biāo)組分直接從基體中分離的萃取過(guò)程。此外,微波還具有萃取效率高、重現(xiàn)性好、快速、節(jié)能、污染小等優(yōu)點(diǎn),不僅降低了操作費(fèi)用,而且符合環(huán)保要求,是一種全新的“綠色”萃取技術(shù)。與ASE和SFE相比,微波又克服了儀器設(shè)備復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn),因此,微波萃取顯示出了良好的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用潛力,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在農(nóng)殘分析、化工、食品、香料、中草藥和化妝品等領(lǐng)域[27-30]。此外,與其他技術(shù)聯(lián)用更推動(dòng)了MAE的進(jìn)步。Carvalho等[29]成功的將 MAE與 HP-SPM E聯(lián)用,并結(jié)合GC/M S檢測(cè)分析了沉淀物中多種有機(jī)氯類農(nóng)藥。

盡管微波萃取在農(nóng)殘分析中有很多優(yōu)點(diǎn),但多數(shù)研究?jī)H局限于揮發(fā)性和半揮發(fā)性農(nóng)藥,而對(duì)其他類農(nóng)藥研究較少,特別是在多類多殘留分析中幾乎沒(méi)有應(yīng)用。此外,微波萃取不易自動(dòng)化,缺少與其他儀器在線聯(lián)機(jī)的可能性,如果能在儀器設(shè)計(jì)上實(shí)現(xiàn)突破,擴(kuò)大微波萃取的應(yīng)用范圍,則該方法會(huì)獲得更強(qiáng)大的生命力。

1.4 吸附提取

1.4.1 固相萃取 固相萃取(SPE)是一種用途廣泛而且越來(lái)越受歡迎的樣品前處理技術(shù)。其分離機(jī)制與液相色譜相同,即利用樣品在吸附劑和洗脫溶劑間的作用差異來(lái)達(dá)到分離的目的。與傳統(tǒng)的液液萃取法和層析色譜法相比,SPE具有選擇性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便快速、便于前處理自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),是目前國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥殘留分析樣品前處理的主流技術(shù)。

SPE有兩種凈化模式,其一是保留目標(biāo)化合物模式,一般包括活化、上樣、淋洗、洗脫四步,得到的樣品溶液可直接用于檢測(cè),目前整個(gè)萃取過(guò)程可以完全自動(dòng)化進(jìn)行。但是在處理混合物時(shí),要求被分離組分對(duì)固定相和流動(dòng)相的作用相近,因此不適合極性范圍太寬的多種類農(nóng)藥的凈化。其二是雜質(zhì)被保留在柱上,待測(cè)組分通過(guò)柱,樣品被凈化但不能富集,也不能分離保留比待測(cè)組分更弱的雜質(zhì),即凈化不完全,但可通過(guò)多種小柱串聯(lián)增強(qiáng)凈化效果,并實(shí)現(xiàn)對(duì)保留能力范圍變化較大的多組分混合物的凈化[31]。

無(wú)論哪種模式,固定相的選擇都是此方法的關(guān)鍵。根據(jù)固定相的性質(zhì)可將萃取方式分為反相 (C18、C8),正相 (Flo risil、氧化鋁、HLB、N H2),離子交換(SCX、SAX),混合機(jī)制(TPH、TPT)和吸附(GCB)五類。常用的洗脫溶劑有甲醇、乙酸乙酯、丙酮和乙腈等,或者它們不同比例的混合溶液。此外,洗脫流速和洗脫溶劑的p H值也不容忽視[32-33]。

固相萃取技術(shù)自開(kāi)發(fā)以來(lái)得到飛速發(fā)展,相應(yīng)的儀器設(shè)備層出不窮,但是我們必須看到對(duì)于理化性質(zhì)范圍很寬的多種組分很難選擇合適的固相萃取柱和洗脫溶劑。此外,高空白值、產(chǎn)品性能的波動(dòng)和處理的樣品量有限仍是目前面臨的主要問(wèn)題[34]。

1.4.2 固相微萃取 固相微萃取(SPM E)是基于萃取涂層與樣品之間的吸附-解吸平衡而建立起來(lái)的集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的樣品制備技術(shù),具有操作簡(jiǎn)單、方便、樣品用量小、無(wú)需有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn),因此它一經(jīng)出現(xiàn)就得到迅速發(fā)展。目前已廣泛用于氣體、液體和固體中的揮發(fā)性、半揮發(fā)性、難揮發(fā)性物質(zhì)的萃取、富集和分析,并與氣相、液相色譜等檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了聯(lián)用。

SPM E與 GC聯(lián)用[35-37]無(wú)需接口裝置,操作簡(jiǎn)單,是目前最為成熟的聯(lián)機(jī)技術(shù)之一。與HPLC聯(lián)用需要一個(gè)特殊的接口裝置,一般采用管內(nèi)固相微萃取模式(in-tube SPM E),通過(guò)溶劑解析作用實(shí)現(xiàn)分離。In-tube SPM E具有更大的萃取表面積和更薄的萃取相膜,富集倍數(shù)相應(yīng)提高,并且易于操作自動(dòng)化,不僅節(jié)省時(shí)間,而且提高了精密度和準(zhǔn)確度[38-39]。SPM E與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[40-43]也正在快速地發(fā)展,不但可進(jìn)行多殘留分析,而且很容易降低檢測(cè)限至μg甚至ng。Sakamoto等[41]采用85μm聚丙烯酸酯萃取頭,頂空-固相微萃取 (HS-SPM E)方式,GC/M S方法測(cè)定水中158種農(nóng)藥的殘留量,最低檢出限達(dá)0.01μg·L-1。

SPM E技術(shù)目前在農(nóng)藥殘留分析方面的應(yīng)用已相當(dāng)成功,特別是隨著聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展及SPM E技術(shù)本身的發(fā)展,SPM E將會(huì)滲透到分析檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域。同時(shí),我們可以看到,盡管目前SPM E與質(zhì)譜結(jié)合還沒(méi)有成為主要的檢測(cè)手段,但應(yīng)用前景看好,很有可能成為農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域的重要角色之一。

1.4.3 基質(zhì)固相分散 基質(zhì)固相分散(M SPD)是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種可同時(shí)進(jìn)行提取和分離的樣品前處理技術(shù)。其主要區(qū)別在于M SPD技術(shù)可以直接處理固態(tài)、半固態(tài)和粘稠樣品,而不需轉(zhuǎn)化成溶液。此技術(shù)的基本原理是將試樣直接與適量吸附劑研磨、混勻制成半固態(tài)物質(zhì)作為填料裝柱,然后選擇合適的有機(jī)溶劑將各種待測(cè)物洗脫下來(lái)。為了加強(qiáng)凈化效果,經(jīng)M SPD柱的淋洗液可通過(guò) Florisil柱進(jìn)一步凈化,或者在柱底填入Florisil、無(wú)水硫酸鈉等,最后的流出液可直接進(jìn)行色譜分析。M SPD用的吸附劑與SPE相同,吸附劑的選擇主要依賴于待測(cè)組分和樣品基質(zhì)的性質(zhì)。反相填料C8[43]和C18[63]易破壞細(xì)胞膜并將組織分散,特別適合此方法,可應(yīng)用于有機(jī)氯、有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯、氨基甲酸酯、吡唑類、甲氧基丙烯酸酯、苯并咪唑類、尿素等的提取。正相吸附劑Florisil[50]、NH2[64]凈化效果好,但可能會(huì)引起一些農(nóng)藥的分解,應(yīng)用范圍不如反相填料廣。此外,一些惰性填料的應(yīng)用也越來(lái)越多[65-67]。洗脫溶劑的種類,洗脫體積,基質(zhì)性質(zhì)等都是優(yōu)化提取條件不可忽視的因素[67]。

不難看出,M SPD特別適合多種類農(nóng)藥的多殘留分析,而且樣品處理速度快,溶劑與樣品使用量少,與靈敏度高、選擇性好的 GC/M S和LC-M S/M S檢測(cè)方法聯(lián)用已成為必然的發(fā)展方向。但是,整個(gè)萃取過(guò)程仍為人力操作,開(kāi)發(fā)與GC/M S和LC-M S/M S聯(lián)機(jī)操作的M SPD方法是主要的發(fā)展趨勢(shì)。

1.5 凝膠滲透色譜

凝膠滲透色譜(GPC)又稱體積排阻色譜,它是按溶質(zhì)分子大小進(jìn)行分離的一種前處理技術(shù)。對(duì)富含油脂、脂肪、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)的樣品進(jìn)行凈化時(shí),GPC是主要的凈化手段[44-49]。與其他前處理方法相比,GPC具有自動(dòng)化程度高、凈化速度快、回收率高且穩(wěn)定等特點(diǎn)。此外,GPC的柱填料與被分離試樣沒(méi)有任何相互作用,不存在不可逆吸附,每個(gè)適用于 GPC分離的樣品都能完全洗脫,從而使 GPC柱的性能得到長(zhǎng)期保持,并能反復(fù)使用。但是,此方法仍有很多不足,例如凈化不完全,農(nóng)藥和樣品基質(zhì)成分通常會(huì)有一部分重疊,即使使用高分辨的凝膠柱也很難達(dá)到完全分離。因此,GPC方法通常還需要結(jié)合一些額外的處理步驟,常用的有 LLE或SPE[45-48]。此外,溶劑消耗量大,儀器維護(hù)費(fèi)用高也是主要問(wèn)題。盡管如此,GPC在高脂肪樣品農(nóng)殘分析中仍發(fā)揮著不可取代的作用。Lesueur等[48]對(duì)4種土壤中農(nóng)殘?zhí)崛艋椒ㄟM(jìn)行比較,證明LLE-GPC法凈化所得到的檢測(cè)限最低,凈化效果最好。

與其他前處理方法一樣,聯(lián)機(jī)技術(shù)是它們發(fā)展的共同趨勢(shì)。GPC與 GC/M S的成功聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)了從樣品前處理到農(nóng)藥檢測(cè)的完全自動(dòng)化,可快速的進(jìn)行多種農(nóng)藥的定性和定量分析,進(jìn)一步提高樣品處理量和自動(dòng)化程度[49]。特別是在處理大量樣品時(shí),此方法顯得更為重要。

2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的研究

液相色譜-質(zhì)譜(LC-M S/MS)聯(lián)用技術(shù)是近20年來(lái)分析領(lǐng)域最重要的進(jìn)展之一,已成功用于分析熱不穩(wěn)定、相對(duì)分子質(zhì)量較大、難以用氣相色譜分析的化合物,具有檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、定性定量同時(shí)進(jìn)行、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。

2.1 色譜部分

農(nóng)藥分離常用的色譜柱是反相C18或C8柱,也有少數(shù)離子型農(nóng)藥使用離子交換柱或離子對(duì)反相色譜柱。由于質(zhì)譜檢測(cè)器的特殊性,人們

已把色譜條件考察的焦點(diǎn)從固定相轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相。目前廣為接受的流動(dòng)相是水與甲醇或乙腈的梯度混合溶劑。其中有機(jī)相的種類、比例、p H值、緩沖鹽的種類及濃度都會(huì)影響分析物的離子化效率,從而影響方法的靈敏度。Jansson等[68]證明樣品在甲醇中的質(zhì)譜信號(hào)普遍高于乙腈,然而在農(nóng)藥多種類多殘留分析中仍多以乙腈為有機(jī)相[14-15,54-60]。此外,在流動(dòng)相中加入適量的揮發(fā)性酸或堿(如甲酸、乙酸銨等)可以起到抑制不穩(wěn)定弱酸或弱堿性農(nóng)藥分解和幫助離子化的作用。

2.2 質(zhì)譜部分

2.2.1 接口系統(tǒng) ESI和 APCI是最常用的液質(zhì)接口系統(tǒng),關(guān)于二者的理論已有很多報(bào)道[8-10],ESI主要用于極性和離子型化合物,APCI則適用于中等極性和弱極性化合物,但在農(nóng)殘分析方面二者并沒(méi)有嚴(yán)格的界線。Thurman等[69]研究了 72種農(nóng)藥的 ESI和 APCI離子化效果,示于圖1,并對(duì)兩種離子源適用農(nóng)藥的極性范圍和種類,以及不同農(nóng)藥的正負(fù)電離模式做了詳細(xì)闡述,指出對(duì)少量農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)時(shí),二者各具優(yōu)勢(shì),但當(dāng)農(nóng)藥的種類大于200時(shí),ESI的靈敏度卻明顯高于 APCI[70]。事實(shí)上,ESI與APCI的靈敏度還與儀器的廠家和型號(hào)有關(guān),特別是隨著近幾年質(zhì)譜儀器的快速發(fā)展,很難得出定論。此外,APPI在農(nóng)殘分析領(lǐng)域也開(kāi)始得到應(yīng)用,其原理與APCI相似,可以認(rèn)為是APCI的補(bǔ)充,用于檢測(cè)非極性和低極性化合物。同時(shí),APPI還降低了基質(zhì)效應(yīng),在農(nóng)殘檢測(cè)過(guò)程中省去了基質(zhì)校正的步驟,不但簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程,更進(jìn)一步擴(kuò)大了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用范圍[71]。

圖1 Thurman[71]繪制的離子源與農(nóng)藥性質(zhì)的關(guān)系圖Fig.1 Diagram showing the relationship between ionization and pesticide performance designed by Thurman[71]

2.2.2 質(zhì)量分析器 LC/M S的質(zhì)量分析器有單四極桿,飛行時(shí)間,串聯(lián)質(zhì)譜(IT、QQQ、Q IT)和混合質(zhì)譜(Q TOF)。單四極桿背景噪音大,在農(nóng)殘分析中很少使用。串聯(lián)質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)可以克服這一缺陷,顯著提高選擇性和靈敏度,因此QQQ成為農(nóng)藥多殘留分析中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)技術(shù)。Lehotay等[4]用TQM S同時(shí)分析了水果、蔬菜中229種農(nóng)藥,靈敏度達(dá)到μg·kg-1水平。Q IT也可以進(jìn)行SRM模式,但其定量性能頗有爭(zhēng)議,Hogenboom等[72]通過(guò)比較Q ITM S和 TQM S的一些定量數(shù)據(jù),認(rèn)為 Q ITM S的最低檢出限高于TQM S的5～30倍,然而,Evans等[7]卻認(rèn)為二者具有相似的LODs,并都能提供常規(guī)檢測(cè)所需的準(zhǔn)確度和靈敏度。Soler等[73]也考查了LCTQ/M S和LC-Q IT/M S在農(nóng)殘分析中的應(yīng)用特點(diǎn),認(rèn)為 TQM S在準(zhǔn)確度、線性和重現(xiàn)性方面都好于Q ITM S。但可以確定的是Q ITM S可進(jìn)行多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析,因此在結(jié)構(gòu)鑒定上比TQMS靈敏。Blasco等[74]用 LC-Q IT/MS3對(duì)多種農(nóng)藥進(jìn)行分析,不但得到了特征裂解途徑,而且提供了足夠的定量信息,可以進(jìn)行準(zhǔn)確定量。TOF的主要優(yōu)點(diǎn)是可以在高分辨條件下操作,并且可以進(jìn)行準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定。準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)可給出元素組成,從而提供結(jié)構(gòu)信息,這是四極桿質(zhì)譜所做不到的。Q TOF結(jié)合了兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),既可以在串聯(lián)狀態(tài)下對(duì)子離子提供準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定,又可以作為單獨(dú)的 TOF質(zhì)譜儀對(duì)前體離子進(jìn)行準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定[75]。但是它不能完成真實(shí)的母離子掃描和中性丟失模式,定量分析的靈敏度比 QQQ低 1個(gè)數(shù)量級(jí)[76]。因此,目前對(duì)Q TOF的研究主要集中在分析未知農(nóng)藥。

2.3 LC-MS/MS的局限性

LC-M S/M S作為一種發(fā)展中的檢測(cè)技術(shù)也存在一定的局限性。ESI與APCI都不能勝任非極性化合物的離子化,盡管理論上APPI可以用于非極性化合物,但還沒(méi)有實(shí)際例子能證明這一點(diǎn)。此外,LC-M S/M S準(zhǔn)確定量至少需要3個(gè)特征離子,對(duì)于一些只有1個(gè)碎片離子的化合物只能不完全定量,如果第2個(gè)離子的豐度不夠高也會(huì)顯著降低分析的靈敏度。LC-M S/M S另一個(gè)不容忽視的問(wèn)題是基質(zhì)效應(yīng),即基質(zhì)干擾物通過(guò)增強(qiáng)或抑制分析物離子化效率來(lái)影響分析結(jié)果。改善色譜分離效果和各種基質(zhì)凈化方法都可以減少但不能完全消除基質(zhì)效應(yīng),校準(zhǔn)法是避免或補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)最有效的方法。其中,同位素內(nèi)標(biāo)法是單個(gè)農(nóng)藥分析時(shí)的最佳選擇,但存在內(nèi)標(biāo)不易找到和價(jià)格昂貴的缺點(diǎn),且不適合多殘留分析。共振峰法是在內(nèi)標(biāo)法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,它也存在局限性,特別是影響同分異構(gòu)體的鑒定。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法是目前多殘留分析中最常用的校準(zhǔn)方法,其不足為每種樣品都需要各自的空白樣品,不能建立通用的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是基質(zhì)效應(yīng)的問(wèn)題已經(jīng)得到廣泛重視,M artínez Vidal等[77]找到了一種通用的空白基質(zhì),可對(duì)多種物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)。A lder等[78]開(kāi)發(fā)了一種新型基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償方法,通過(guò)在柱后加入一種監(jiān)測(cè)物質(zhì)可永久性補(bǔ)償多殘留分析中基質(zhì)效應(yīng),不但改善了回收率,而且顯著減少了分析時(shí)間。我們相信,隨著LC-M S/M S方法的發(fā)展和普及,會(huì)有更多更有效的方法來(lái)克服這種不足。

3 LC-MS/MS在中藥農(nóng)殘分析中的研究現(xiàn)狀

目前,LC-M S/M S的研究主要集中于多殘留分析和一些性質(zhì)特殊的單個(gè)或幾個(gè)農(nóng)藥的分析,農(nóng)藥種類涉及氨基甲酸酯、有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯、苯并咪唑、三唑類等。前處理過(guò)程是多殘留分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié),美國(guó)食品藥品管理局根據(jù)樣品中脂肪、水和糖的含量進(jìn)行分類,建立相應(yīng)的前處理方法。而中藥由于其成分復(fù)雜,很難找出通用的分類依據(jù)。中藥凈化最常用的方法是吸附柱色譜法,如 Florisil、氧化鋁、硅膠等。Florisil是中藥凈化最好的吸附材料,特別適合從非極性基質(zhì)中分離極性化合物。一些先進(jìn)的提取技術(shù)在中藥中的應(yīng)用也有報(bào)道,但研究不夠深入,還沒(méi)有充分發(fā)揮出它們的優(yōu)勢(shì)[78-82]。

縱觀各國(guó)對(duì)農(nóng)殘分析的研究不難發(fā)現(xiàn),LCMS/MS在環(huán)境污染和食品安全方面發(fā)展得最快,特別是近幾年,由于對(duì)多殘留分析的關(guān)注和對(duì)最大殘留限量的嚴(yán)格規(guī)定,LC-M S/M S的應(yīng)用幾乎達(dá)到了高峰。但是,它在中藥農(nóng)殘領(lǐng)域的應(yīng)用卻寥寥無(wú)幾[11-12],完全沒(méi)有發(fā)揮出其高選擇性和高靈敏度的優(yōu)勢(shì),這也是制約中藥農(nóng)殘分析發(fā)展的主要因素之一。

4 結(jié)論與展望

近些年來(lái),農(nóng)殘超標(biāo)問(wèn)題屢屢出現(xiàn),農(nóng)殘分析已成為分析化學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn),而質(zhì)譜的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了這一問(wèn)題的解決。LC-M S/M S已經(jīng)成功應(yīng)用到環(huán)境食品等各個(gè)領(lǐng)域,但在中藥農(nóng)殘分析中仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。此外,化學(xué)成分復(fù)雜、各異,無(wú)法建立通用的前處理方法依然是面臨的主要問(wèn)題。充分利用現(xiàn)有技術(shù)建立簡(jiǎn)單,廉價(jià),環(huán)保,可靠的分析方法是中藥質(zhì)量監(jiān)控的首要任務(wù)。

同時(shí)我們必須看到,LC-M S/M S作為最有潛力的分析技術(shù),仍有很大的發(fā)展空間。小型或微型色譜柱的開(kāi)發(fā)、接口技術(shù)的改進(jìn)和完善、M S譜庫(kù)識(shí)別技術(shù)的發(fā)展以及基質(zhì)效應(yīng)的徹底解決都是分析工作者們需要關(guān)注的方向。有理由相信,隨著液質(zhì)技術(shù)的日益成熟,其必會(huì)在中藥農(nóng)殘分析中發(fā)揮重要的作用。

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Advances on Traditional Chinese Medicine Application of Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry and Correspondingly Sam ple Preparations in Pesticide Residue Analysis

CHEN Li-na1,2,SONG Feng-rui1,L IU Zhi-qiang1
(1.Changchun Institute of A pp lied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun 130022,China;2.Graduate School of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

The past few years show the considerable potential in the app lication of liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-M S/M S)to control pesticide residues for insure environment and food safety.This review focuses on the advances of LC-M S/M S analysis of pesticide residues and especially addressed its app lications and p rospect in the traditional Chinese medicine(TCM).Some samp le p reparation techniques which recently developed and extensively used are also surveyed as they are still mandato ry in many app lications for the reason of time consuming and easily errors.Furthermore,emphasis is p laced on the advantages and disadvantages of them in order to p rovide information for pesticide residue control in Chinese medicine production.

Chinese herbalmedicine;pesticide residues;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-M S/M S);p reparation

劉志強(qiáng)(1962～),男(漢族),教授,博士生導(dǎo)師,從事天然藥物化學(xué)與有機(jī)質(zhì)譜學(xué)研究。E-mail:liuzq@ciac.jl.cn

O 657.63

A

1004-2997(2010)06-0342-12

2010-10-01;

2010-11-10

國(guó)家科技部科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2009ZX09308-006),國(guó)家科技部創(chuàng)新方法研究專項(xiàng)(2010IM 030400)資助

陳麗娜(1984～),女(漢族),博士研究生,分析化學(xué)專業(yè)。E-mail:m slab29@ciac.jl.cn