劉芙蓉，張成宏，高建 ，李豐

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，細(xì)胞生物學(xué)衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，沈陽(yáng) 110001）

西咪替丁增強(qiáng)5-氟脲嘧啶對(duì)人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

劉芙蓉1，張成宏1，高建2，李豐1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，細(xì)胞生物學(xué)衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，沈陽(yáng) 110001）

目的 觀察不同濃度的西咪替丁、5-氟脲嘧啶（5-Fu）單用或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823生長(zhǎng)及凋亡的影響。方法 用MTT法檢測(cè)西咪替丁與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823存活率的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)西咪替丁與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果 西咪替丁與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，西咪替丁在無(wú)毒濃度（5～50μmol/L）即可顯著增強(qiáng)低濃度5-Fu對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，西咪替丁能增強(qiáng)5-Fu誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。結(jié)論 西咪替丁可提高人胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823對(duì)化療藥物5-Fu的敏感性，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

西咪替??；5-氟脲嘧啶；聯(lián)合應(yīng)用；胃腫瘤細(xì)胞株

西咪替丁是一種H2受體阻斷劑，廣泛用于胃、十二指腸潰瘍和返流性食管炎的治療。5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）是非典型細(xì)胞周期特異性抗代謝類(lèi)藥物，它不僅對(duì)癌細(xì)胞S期，對(duì)其他期亦有作用，已成為胃癌化療中的主要藥物。近些年來(lái)在臨床實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，西咪替丁與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用可明顯延長(zhǎng)結(jié)直腸癌患者的生存率［1，2］。但聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察西咪替丁單用或與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823生長(zhǎng)抑制作用及細(xì)胞凋亡的影響，為臨床抗癌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：胃癌細(xì)胞株MGC-803、BGC-823由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)研室提供。

1.1.2 主要試劑：西咪替?。–imetidine）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙錠（PI）、Rnase、噻唑藍(lán)（MTT）（美國(guó)Sigma公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco BRL公司）；胎牛血清（天津 TBD）；5-Fu（上海旭東海普藥業(yè)公司）。

1.1.3 主要儀器：流式細(xì)胞儀 Facscalibur（美國(guó)BD公司）、超速離心機(jī)4K15（美國(guó)Sigma公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱Thermo Forma（美國(guó)）、酶標(biāo)儀Tecan（澳地利）、相差倒置顯微鏡NIKONTMS（日本）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素），在37℃、5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。0.25%trypsin+0.02%EDTA消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物分組：據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將西咪替丁與5-Fu用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。實(shí)驗(yàn)分3組（每組中各濃度段均設(shè)4個(gè)平行孔）：（1）西咪替丁組：西咪替丁濃度分別為 1、5、10、50、100、250、500μmol/L；（2）5-Fu 組：5-Fu 濃度分別為 10、50、100、200μmol/L；以上兩組均設(shè)對(duì)照（不加藥只加培養(yǎng)液）；（3）聯(lián)合組：除按5-Fu濃度外，每孔分別另加1、5、10、50μmol/L西咪替丁，并分別以相應(yīng)濃度的西咪替丁和5-Fu作為對(duì)照。

1.2.3 MTT法：調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/ml，以每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)4個(gè)平行孔。藥物作用 24、48h 后，每孔加入 MTT20μl（5mg/ml），振蕩混勻。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm波長(zhǎng)，在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值（A），計(jì)算各組MGC-803、BGC-823細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：不同濃度藥物作用48h后，胰酶消化收集細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液，PBS洗2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)（細(xì)胞密度大于106/ml），加入70%冷乙醇4℃固定24h以上。PBS洗2次除盡乙醇，加RNaseA至終濃度0.5mg/ml，37℃溫育30mim。4℃PI染液至終濃度50μg/ml，暗室孵育1h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每次計(jì)數(shù)2×104個(gè)細(xì)胞，以凋亡指數(shù)（APO）表示細(xì)胞凋亡情況。APO=（凋亡細(xì)胞數(shù)/所測(cè)細(xì)胞數(shù)）×100%

圖1 西咪替丁促進(jìn)5-氟對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Fig.1 Cimetidine enhance the antiproliferative effect of 5-Fu

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS12.0軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，組間比較用SLD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西咪替丁對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

以不同濃度西咪替丁分別處理貼壁生長(zhǎng)的人胃癌細(xì)胞24h、48h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)250μmol/L以上濃度時(shí)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯的抑制（P<0.05），并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性，濃度越大，時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯；低于100μmol/L以下濃度則未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒作用。

2.2 聯(lián)合用藥對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

取低于100μmol/L的4個(gè)無(wú)毒西咪替丁濃度，觀察其與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果如圖1A～D所示，單用5-Fu，可有效抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823的生長(zhǎng)，抑制作用呈濃度與時(shí)間依賴(lài)性；1、5、10、50μmol/L無(wú)毒濃度西咪替丁與 5-Fu聯(lián)合應(yīng)用后，發(fā)現(xiàn) 5、10、50μmol/L西咪替丁在24h或48h均可顯著增強(qiáng)5-Fu對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823的生長(zhǎng)抑制作用（P<0.01），且在同一5-Fu濃度時(shí)，隨西咪替丁濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，5、10、50μmol/L西咪替丁與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用可有效降低5-Fu單用的IC50值（圖 2）。

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡的影響

圖2 西咪替丁與5-氟聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞的5-Fu IC50值的影響Fig.2 The influence of 5-Fu IC50for cimetidine combination with 5-Fu

取 10、50μmol/L無(wú)毒濃度西咪替丁與 50、100、200μmol/L濃度5-Fu單用或聯(lián)合應(yīng)用后，發(fā)現(xiàn)無(wú)毒濃度西咪替丁組與對(duì)照組比較，人胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823的凋亡率無(wú)明顯影響（P>0.05），而50、100、200μmol/L5-Fu 組可使人胃癌細(xì)胞凋亡數(shù)增多，且可見(jiàn)典型凋亡峰，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。當(dāng)不同濃度 5-Fu與 10、50μmol/L無(wú)毒濃度西咪替丁聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，與單用同等濃度5-Fu組比較，人胃癌細(xì)胞凋亡率均顯著增加（P<0.01），見(jiàn)表1。

表1 單用或聯(lián)合用藥對(duì)MGC-803、BGC-823凋亡率的影響（±s，n=3）Tab.1 The influence of apoptotic rate of MGC-803，BGC-823for cimetidine combination with 5-Fu（x ±s，n=3）

表1 單用或聯(lián)合用藥對(duì)MGC-803、BGC-823凋亡率的影響（±s，n=3）Tab.1 The influence of apoptotic rate of MGC-803，BGC-823for cimetidine combination with 5-Fu（x ±s，n=3）

1）Compared with control group，P<0.01；2）Compared with Relative Concentration 5-FU，P<0.01.

Group Concenration Apoptoticrate（%）5-FU（μmol/L） Cimetidine（μmol/L） MGC-803 BGC-8231000.82±0.17 0.71±0.23210 0.74±0.15 0.83±0.193050 0.94±0.10 0.89±0.160450 0 5.14±0.831） 4.67±0.671）5100 0 6.31±1.251） 8.91±1.741）6200 0 11.62±2.341） 14.13±2.161）750 10 8.43±1.221），2） 8.49±1.721），2）8100 10 10.78±1.731），2） 13.56±2.081），2）9200 10 18.89±3.531），2） 20.31±2.451），2）10 50 50 11.39±2.561），2） 10.97±2.461），2）11 100 50 18.32±3.741），2） 20.61±4.041），2）12 200 50 22.16±3.151），2） 26.79±3.781），2）

3 討論

西咪替丁是一種安全而有效的化學(xué)合成藥物。有研究表明西咪替丁可以明顯提高胃腸道癌癥患者的生存率［3，4］。相關(guān)研究認(rèn)為，其抗腫瘤的重要機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)各部分功能從而起到免疫調(diào)節(jié)的作用。具體為通過(guò)抑制T抑制性淋巴細(xì)胞（TS細(xì)胞）功能，增強(qiáng)輔助性T淋巴細(xì)胞（TH細(xì)胞）產(chǎn)生白介素（IL-2），以及促進(jìn)天然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）活性等，從而提高機(jī)體的免疫能力和具抗腫瘤作用［5，6］，而 Rajendra 等［7］最新研究表明，西咪替丁可直接抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞CaCo-2的增殖并促進(jìn)其凋亡。與此同時(shí)Komatsubara等［8］經(jīng)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620及其耐藥細(xì)胞系SW620-Ad300的研究發(fā)現(xiàn)，西咪替丁在體外無(wú)免疫機(jī)制參與的條件下，即可顯著增強(qiáng)5-Fu對(duì)SW620的殺傷作用。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了西咪替丁與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823生長(zhǎng)及凋亡的影響。

經(jīng)用MTT法證實(shí)，100μmol/L以下的西咪替丁對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，只有其濃度高于250μmol/L時(shí)，才對(duì)癌細(xì)胞有顯著的生長(zhǎng)抑制（P<0.01）。因此本實(shí)驗(yàn)選用了1、5、10、50μmol/L這 4個(gè)無(wú)毒作用濃度的西咪替丁與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用，來(lái)更加確切地觀察聯(lián)合應(yīng)用的效果。發(fā)現(xiàn)5、10、50μmol/L3個(gè)濃度的西咪替丁均能顯著提高小劑量 5-Fu（10、50、100、200μmol/L）的細(xì)胞殺傷作用，且在同一5-Fu濃度時(shí)，隨著西咪替丁濃度的增加，其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)。5-Fu是臨床上常用的化療藥，其抗腫瘤作用與其激活caspase-3，致使線粒體釋放細(xì)胞色素C，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡有關(guān)［9］。因而，本實(shí)驗(yàn)又研究了西咪替丁與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞凋亡率的變化。發(fā)現(xiàn)西咪替丁在無(wú)毒濃度下，即可顯著增強(qiáng)5-Fu誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。提示西咪替丁增強(qiáng)5-Fu對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823的生長(zhǎng)抑制作用可能是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。有報(bào)道認(rèn)為西咪替丁可被P-糖蛋白識(shí)別并泵出胞外［10，11］。P-糖蛋白是由MDR1基因編碼的，ATP依賴(lài)性跨膜糖蛋白，能將多種藥物泵出胞外，從而減弱藥物的細(xì)胞毒作用，產(chǎn)生耐藥性［12，13］。是否由于西咪替丁的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用而使5-Fu的胞內(nèi)濃度提高，從而增加其細(xì)胞毒作用仍有待進(jìn)一步研究。

本研究表明，西咪替丁在無(wú)毒劑量時(shí)即可大大提高低劑量5-Fu對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823的殺傷作用，并達(dá)到較理想的效果。因此在臨床應(yīng)用時(shí)可減低5-Fu用量，有可能使藥物毒副作用降低，對(duì)于克服腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性有一定的理論意義。盡管西咪替丁增強(qiáng)5-Fu生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)理仍有待進(jìn)一步深入研究，但本研究為臨床聯(lián)合應(yīng)用西咪替丁、5-Fu治療胃癌提供了理論基礎(chǔ)。

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（編輯 裘孝琦，英文編輯 趙傳勝）

Cimetidine Enhances the Antiproliferative Effects of 5-fluorouracil on Human Gastric Cancer Cells

LIUFu-rong1，ZHANGCheng-hong1，GAOJian2，LIFeng1
（1.Department of Cell Biology，The Key Laboratory of Cell Biology，Ministry of Public Health of China，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001；2.Center of Experimental Technology，China Medical University，Shenyang 110001）

ObjectiveTo investigate the effect of cimetidine and 5-fluorouracil（5-Fu）lonely or combination on proliferation and apoptosis of human gastric cancer cells MGC-803，BGC-823in vitro.MethodsMTTassay was used to examine the effect of cimetidine and 5-Fu on the proliferation of MGC-803，BGC-823cells；flow cytometry was used for estimating apoptosis.ResultsWhen cimetidine used in combination with 5-Fu，cimetidine can significantly enhance the antiproliferative effect of lower concentration 5-Fu in no toxic concentrations（5～50μmol/L）on human gastric cancer cells.Meanwhile it also increased 5-Fu to induce the cells apoptosis.ConclusionCimetidine can increase the chemosensitivity of 5-Fu in human gastric cancer cells MGC-803，BGC-823in vitro，inhibit the cells proliferation and promote their apoptosis at higher degree.

cimetidine；5-Fu；combination；stomach neoplasms

Q279

A

0258-4646（2010）12-1021-03

劉芙蓉（1967-），女，實(shí)驗(yàn)師，本科.

李豐，E-mail：fli@mail.cmu.edu.cn

2010-07-07

·短篇論著·