董 潔， 方玉婷， 郭立瑋

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方分離工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210029)

中藥復(fù)方提取物本質(zhì)上是一種化學(xué)復(fù)雜體系，其中包括“基本活性物質(zhì)”以及與其共存的“伴生物質(zhì)”［1］。目前所采用的水提醇沉，樹(shù)脂吸附，膜分離等提取、精制手段其目的都是去除提取物中的伴生物質(zhì)，保留基本活性物質(zhì)。以上幾種方法因各自技術(shù)原理不同，不僅對(duì)復(fù)方中指標(biāo)性成分保留率不同且所除去的伴生物質(zhì)的種類與多少也有差異。鑒于物化參數(shù)變化是伴生物質(zhì)除去的這一微觀過(guò)程的綜合表征，本實(shí)驗(yàn)以芍藥甘草湯為試驗(yàn)體系，以指標(biāo)性成分的含量以及物化參數(shù)為指標(biāo)，探索不同的提取、精制方法對(duì)芍藥甘草湯體系中“基本活性物質(zhì)”以及“伴生物質(zhì)”的影響。

1 儀器與藥品

高效液相色譜儀(Waters515泵，WaterU6K進(jìn)樣器，Waters2487紫外檢測(cè)器，JS－3030江申通用漢化色譜工作站);ShimazhuLibrorAEL－40SM(十萬(wàn)分之一)電子天平(日本島津)，PHSJ－4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，DDSJ－308A電導(dǎo)率儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，SZD－2型智能化散射光濁度儀(上海自來(lái)水設(shè)備工程公司)，NDJ－1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);LDZ5－2型自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

所用藥材均購(gòu)自南京市藥材公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2005版一部的規(guī)定;芍藥苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用 批號(hào)110715－200212)，甘草酸對(duì)照品(供含量測(cè)定用批號(hào)110731－200306)，甘草苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用 批號(hào) 111610－200604)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢測(cè)所;甲醇、乙腈為色譜純(江蘇漢邦科技有限公司)，其余試劑均為分析純。

2 提取工藝

按處方比例稱取各味藥，浸泡0.5 h，加水煎煮3次:第1次加10倍量水，煎煮1 h;第2次加8倍量水，煎煮1 h;第3次加8倍量水，煎煮1 h，并分別用300目濾布濾過(guò)，合并濾液，得濃度為0.04 g生藥/mL的水提液，待用。

3 精制工藝

水提液采用醇沉法、離心法、大孔樹(shù)脂吸附法、絮凝法、微濾法、超濾法等幾種常用的分離工藝精制，比較了不同精制液中指標(biāo)性成分(芍藥苷、甘草苷、甘草酸)含量，以及物理化學(xué)參數(shù)(pH、電導(dǎo)率、濁度、黏度)。

3.1 醇沉法 采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)選，確定最佳醇沉工藝為:取水提液1 000 mL濃縮至1.5 g生藥/mL，不斷攪拌該濃縮液同時(shí)緩緩加入計(jì)算量的乙醇至含醇量達(dá)到70%，醇沉?xí)r間14 h，濾過(guò)，取上清液，揮至無(wú)醇味后，用蒸餾水定容至1 000 mL。

3.2 離心法 取水提液1 000 mL離心(3 000 r/min，12 min)，傾出上清液并用蒸餾水定容至1 000 mL。

3.3 大孔樹(shù)脂吸附法 以芍藥苷、甘草苷、甘草酸三種成分的吸附量為指標(biāo)通過(guò)考察五種不同型號(hào)樹(shù)脂的靜態(tài)吸附以及動(dòng)態(tài)吸附－洗脫選擇最佳樹(shù)脂為HPD100。同時(shí)，以上述3種成分的保留率為指標(biāo)通過(guò)單因素考察確定最佳工藝為:取水提液1 000 mL并濃縮至濃度為0.05 g生藥/mL，取該濃縮液以1.5 mL/min的流速通過(guò)已預(yù)處理的HPD100樹(shù)脂柱(樹(shù)脂床的體積約125 mL)，先用500 mL水洗脫，再用70%乙醇500 mL洗脫，收集醇洗脫液，揮至無(wú)醇味后，用蒸餾水定容至1 000 mL待用。

3.4 絮凝法 取水提液1 000 mL濃縮至0.16 g生藥/mL，并加殼聚糖溶液(殼聚糖－醋酸－水=1∶1∶100)20 mL，靜置24 h，過(guò)濾，取濾液并用蒸餾水定容至1 000 mL待用。

3.5 微濾法 取水提液1 000 mL離心(3 000 r/min，12 min)，傾出上清液并用孔徑為0.2 μm的中空聚偏氟乙烯膜組件以錯(cuò)流方式進(jìn)行循環(huán)微濾，待微濾液收集到800 mL后，加入200 mL水，繼續(xù)微濾直至收集到1 000 mL為止。

3.6 超濾法 取水提液1 000 mL按3.5項(xiàng)進(jìn)行微濾后，用截留分子量為1～3萬(wàn)的中空聚砜纖維膜組件以錯(cuò)流方式進(jìn)行循環(huán)超濾，待超濾液收集到約800 mL時(shí)，加入200 mL水，繼續(xù)超濾，至收集到1 000 mL為止。

4 指標(biāo)性成分含量及物理化學(xué)常數(shù)測(cè)定

4.1 pH測(cè)定 取樣品20 mL，以校正過(guò)的精密PHSJ－4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)測(cè)定樣品的pH值。

4.2 電導(dǎo)率測(cè)定 取樣品20 mL，在溶液溫度為20℃時(shí)，測(cè)定其電導(dǎo)率。

4.3 濁度測(cè)定 取樣品50 mL，以SZD－2型智能化散射光濁度儀測(cè)定樣品的濁度值。

4.4 黏度測(cè)定 取樣品20 mL，以NDJ－1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定樣品在20℃時(shí)的黏度值。

4.5 固含率的測(cè)定 精密移取樣品20 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿(W1)中，水浴蒸干，于105℃烘箱中干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速稱重(W2)，計(jì)算固含率。固含率(mg/mL)=(W2－W1)/20。

4.6 指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法

4.6.1 芍藥苷測(cè)定色譜條件［2］69色譜柱為 Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈 －0.1%磷酸溶液(13∶87)，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，流速為1.0 mL/min。

4.6.2 甘草苷測(cè)定色譜條件［2］59－60色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈 －1.1%冰醋酸(1∶4)，檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm，流速為1.0 mL/min。

4.6.3 甘草酸測(cè)定色譜條件［2］59－60色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇 －0.2 mol/mL 醋酸銨溶液－冰醋酸(67∶33∶1.5);檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，流速為1.0 mL/min。

以上色譜條件經(jīng)方法學(xué)考察，在所選定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性均良好。

表1 固含及指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果

5 結(jié)果

5.1 固含及指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果 從固含來(lái)看，芍藥甘草湯分別經(jīng)過(guò)上述幾種方法處理后固含明顯減少，幾種精制液固含由低到高的順序?yàn)?大孔樹(shù)脂洗脫液＜醇沉液＜超濾液＜絮凝液＜微濾液＜離心液。從指標(biāo)性成分保留率來(lái)看，不同的精制方法對(duì)指標(biāo)性成分的保留率不盡相同。如:對(duì)芍藥苷而言微濾法和離心法的保留率較高，但超濾法和絮凝法較低。對(duì)甘草苷、甘草酸而言離心法較為理想但超濾法的保留率較低。從浸膏中指標(biāo)性成分含量來(lái)看，由于不同的精制方法對(duì)指標(biāo)性成分的保留率不同以及不同精制方法的出膏率也不同，最終導(dǎo)致不同浸膏中指標(biāo)性成分的含量存在差異。綜上所述，幾種方法對(duì)芍藥甘草湯都有精制作用，但通過(guò)不同方法精制后芍藥甘草湯體系中指標(biāo)性成分的含量以及各指標(biāo)性成分之間的比例都有明顯改變。這種改變是否會(huì)影響芍藥甘草湯整體藥效，有待從藥代動(dòng)力學(xué)以及藥效學(xué)做進(jìn)一步研究。

5.2 物理化學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果

5.2.1 pH、黏度 由圖1可知芍藥甘草湯水提液和不同精制液的黏度變化不大。但pH在4～6有明顯波動(dòng)，其中超濾液和微濾液的pH最低，而大孔樹(shù)脂精制液pH最高。pH不同有可能改變化學(xué)體系中蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)，以及各成分間的絮凝，沉降性能和過(guò)濾性能。有文獻(xiàn)報(bào)道由于給藥體系的pH值不同可以改變藥物尤其是弱電解質(zhì)藥物(如鹽酸小檗堿)的解離度，從而影響藥物透過(guò)生物膜的難易程度，未解離的分子型藥物比離子型藥物易于透過(guò)生物膜［3］296。

5.2.2 電導(dǎo)率、濁度 濁度是表明液體澄清度的指標(biāo)，泥沙，藥渣碎片，微粒以及沒(méi)有用的大分子膠體都能增加液體的濁度。由圖2可知經(jīng)過(guò)不同的方法處理后芍藥甘草湯體系的濁度值大幅度下降，該結(jié)果表明幾種方法都能除去體系中懸浮顆粒和膠體物質(zhì)，提高澄清度。其中大孔樹(shù)脂吸附法，超濾法，微濾法效果尤為明顯。

圖1 pH、黏度測(cè)定結(jié)果

圖2 電導(dǎo)率、濁度測(cè)定結(jié)果

電導(dǎo)率是衡量溶液體系離子多少的一個(gè)指標(biāo)，也是描述膠體溶液體系變化的重要指標(biāo)，與中藥提取液中的帶電膠體粒子(如蛋白和鞣質(zhì))密切相關(guān)。圖2表明除離心液外，其他幾種精制液的電導(dǎo)率較水提液都有改變。其中醇沉液、大孔樹(shù)脂洗脫液、超濾液、絮凝液電導(dǎo)率有所降低，且大孔樹(shù)脂洗脫液降低尤為明顯，而微濾液的電導(dǎo)率則有所升高。有研究認(rèn)為:形成離子對(duì)可促進(jìn)帶電藥物的吸收。離子對(duì)在溶液中通過(guò)靜電吸引所形成中性物質(zhì)使電荷消失，藥物的理化性質(zhì)、親脂性增強(qiáng)，易于藥物透過(guò)生物膜。因而電導(dǎo)率是影響溶液中藥物吸收的因素之一［3］29。

6 討論

綜上所述，芍藥甘草湯經(jīng)過(guò)不同的方法處理后其物質(zhì)組成發(fā)生了很大的改變。那么如何對(duì)不同的精制方法進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)?有文獻(xiàn)報(bào)道以指標(biāo)性成分含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，但從本文的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，由于每一種精制方法對(duì)三種指標(biāo)性成分的保留率不盡相同，因此，僅以某種指標(biāo)性成分含量的高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏一定的合理性。又有文獻(xiàn)報(bào)道［4］伴生物質(zhì)可改變基本活性物質(zhì)的理化性質(zhì)，從而影響生物藥劑學(xué)參數(shù)，特別影響活性物質(zhì)從藥物處方或植物提取物中的溶出和進(jìn)一步吸收。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同的精制液的物理化學(xué)參數(shù)有明顯的差異，也即芍藥甘草湯經(jīng)過(guò)不同的方法精制后，伴生物質(zhì)發(fā)生了明顯的改變，那么，這種伴生物質(zhì)的改變將怎樣影響活性物質(zhì)在體內(nèi)的吸收以及對(duì)活性物質(zhì)從提取物中溶出有何影響我們正在做進(jìn)一步研究，試圖從復(fù)雜的數(shù)據(jù)中挖掘出物理化學(xué)參數(shù)和生物藥劑學(xué)的相關(guān)性，嘗試從物理化學(xué)參數(shù)的角度為中藥的精制分離方法建立一種合理的評(píng)價(jià)體系。

［1］郭立瑋，潘林梅，朱華旭.中藥提取物伴生物質(zhì)的生物藥劑學(xué)特性及其制劑學(xué)意義［J］.中草藥，2007，38(8):1281.

［2］中國(guó)藥典［S］.2005:69.

［3］蘇德森.物理藥劑學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:296.

［4］Rainer H M，Gesine E H著，胡晉紅主譯.現(xiàn)代給藥系統(tǒng)的理論和實(shí)踐［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2004:78.