楊亞麗 李富榮

·綜述與講座·

間充質(zhì)干細(xì)胞在糖尿病細(xì)胞療法中的研究現(xiàn)狀

楊亞麗 李富榮

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞,在細(xì)胞替代治療中有極其重要的作用。MSCs來源廣泛，幾乎所有的成體和胚胎組織中都有MSCs[1]。目前研究較多的是骨髓、脂肪、滑膜、臍帶血、胎肝、羊膜等來源的MSCs。MSCs最重要的特性是多能性，能分化成多種不同的細(xì)胞譜系，如骨、脂肪、軟骨等間質(zhì)細(xì)胞譜系，以及神經(jīng)元、肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞[2-3]。MSCs同樣具有分化為胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的可塑性，已經(jīng)證實來源于各組織中的MSCs可以分化為有功能的胰島素分泌細(xì)胞。本文就MSCs分化為胰島樣細(xì)胞的方法和分化機(jī)制做一綜述。

一、MSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞

1．體外誘導(dǎo)：胰島樣細(xì)胞[4](insulin-producing cells，IPCs)是指能表達(dá)胰腺發(fā)育相關(guān)基因和功能相關(guān)基因(如胰島素Ⅰ 、胰島素Ⅱ、葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子2、葡萄糖激酶、胰島淀粉樣多肽、Nestin、PDX-1和Pax 6等)并能合成、分泌胰島素和C-肽的細(xì)胞。多種組織來源的MSCs，如骨髓、脂肪、外周血、胰腺等，都被成功誘導(dǎo)分化為IPCs。

用高糖培養(yǎng)基或高濃度尼克酰胺培養(yǎng)大鼠MSCs，可使細(xì)胞分化為IPCs，表達(dá)胰島素mRNA并分泌胰島素[5-7]。聯(lián)合使用尼克酰胺、活化素A和β細(xì)胞因子的三階段誘導(dǎo)方案，用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)糖尿病患者M(jìn)SCs，能有效促進(jìn)MSCs分化為IPCs，培養(yǎng)最后階段分化細(xì)胞形態(tài)和胰島非常類似，高表達(dá)PDX-1、胰島素和胰高血糖素基因，有葡萄糖劑量相關(guān)的胰島素分泌[7]。

脂肪組織中有大量間充質(zhì)祖細(xì)胞(adipose-derived stromal cells，ADSCs),與MSCs有類似表型和分化能力。在人體，分離ADSCs創(chuàng)傷小、來源豐富，因而更為實用。Timper等[8]和Eberhardt等[9]學(xué)者分離出ADSCs，加入成纖維細(xì)胞生長因子培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)記物Scf 和Thy1,并表達(dá)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化產(chǎn)生所必須的Isl1 mRNA；分化的IPCs中Ipf1、Isl1、ngn 3、胰島素等基因以及胰高血糖素、胰多肽和C-肽的表達(dá)水平上調(diào)。

人臍帶外周血間充質(zhì)祖/干細(xì)胞，是臍帶血(human umbilical cord blood，hUCB)中分離的單個核貼壁細(xì)胞，有MSCs類似的表型和分化能力。Pessina等[10]發(fā)現(xiàn)UCB細(xì)胞在含胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即使不添加任何細(xì)胞因子和生長因子，細(xì)胞亦可表達(dá)上皮細(xì)胞的特征標(biāo)記和胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的必需基因Isl1、PDX-1、Pax 4和ngn 3。Chao等[11]用四階段培養(yǎng)方案，從hUCB誘導(dǎo)出胰島樣細(xì)胞團(tuán)，表達(dá)胰島素和胰腺β細(xì)胞相關(guān)基因PDX-1、Hlxb9、Nkx 2.2、Nkx 6.1和GLUT2，對葡萄糖刺激有胰島素和C-肽釋放反應(yīng)。因此，hUCB也是IPCs很重要的來源。

人類胰島中存在胰腺祖/干細(xì)胞，有黏附生長的特性，表達(dá)MSCs的分子標(biāo)記，能向骨、脂肪和軟骨分化，被認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞。Davani等[12]發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞有很強增殖能力，體外擴(kuò)增1000倍仍維持未分化狀態(tài)，不表達(dá)胰島素mRNA。誘導(dǎo)分化4 d有上皮細(xì)胞簇(epithelial cell clusters，ECCs)形成， ECCs移植到糖尿病鼠能分化為成熟的胰島功能細(xì)胞，對葡萄糖刺激有C-肽和胰島素分泌；胰高血糖素和胰多肽的轉(zhuǎn)錄隨時間增加。Baertschiger等[13]將胰腺MSCs體外擴(kuò)增了40倍，擴(kuò)增過程中細(xì)胞表達(dá)Isl1、Nkx 2.2、Nkx6.1、nestin、ngn 3、PDX-1和NeuroD，活化素A和肝細(xì)胞生長因子可誘導(dǎo)其表達(dá)胰島素、胰高血糖素和葡萄糖激酶。

2．基因修飾：MSCs易于外源基因的插入，適宜作為很多疾病基因療法的“細(xì)胞載體”。隨著干細(xì)胞檢測手段和載體生物學(xué)的發(fā)展，MSCs的轉(zhuǎn)基因效率明顯提高。已經(jīng)證實很多基因，如凝血因子Ⅷ、Ⅸ、IL-3、人生長激素、人促紅細(xì)胞生成素等，轉(zhuǎn)入MSCs后能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

Lu等[14]用逆轉(zhuǎn)錄病毒將人胰島素基因轉(zhuǎn)入hMSCs，hMSCs表達(dá)胰島素mNRA，并能穩(wěn)定分泌胰島素。Li等[15]用逆轉(zhuǎn)錄病毒將PDX-1轉(zhuǎn)入hMSCs，誘導(dǎo)hMSCs分化為IPCs，表達(dá)ngn 3、insulin、GK、Glut2 和胰高血糖素，微量葡萄糖能刺激其分泌胰島素。Li等[16]使用質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染PDX-1 和BTC兩個基因， 誘導(dǎo)MSCs分化胰腺細(xì)胞譜系，產(chǎn)生胰島樣結(jié)構(gòu)，對葡萄糖刺激有胰島素分泌。

3．蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)是近年來新出現(xiàn)的技術(shù)。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domains ，PTDs)或細(xì)胞穿透肽等很多肽類，能夠轉(zhuǎn)移進(jìn)入到活細(xì)胞，而且無論在體外或體內(nèi)，細(xì)胞攝入的全長蛋白和多肽都能發(fā)揮生物活性。

胰腺內(nèi)分泌分化的兩個重要轉(zhuǎn)錄因子，PDX-1和BETA2/NeuroD都含有PTD結(jié)構(gòu)。Noguchi等[17-18]用PDX-1蛋白或BETA2/NeuroD蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入胰腺導(dǎo)管前體細(xì)胞，成功誘導(dǎo)其表達(dá)胰島素。Domínguez-Bendala等[19]用TAT介導(dǎo) ngn 3蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)能刺激胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化。Kilk等[20]報道，Isl-1轉(zhuǎn)錄因子的同源結(jié)構(gòu)能被細(xì)胞納入，可以推論其轉(zhuǎn)導(dǎo)后也能誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化。因此，利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將PDX-1、BETA2/NeuroD、ngn 3、Isl-1等轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入MSCs，誘導(dǎo)MSCs分化IPCs，不需要基因轉(zhuǎn)染，很方便地使干細(xì)胞分化為IPCs。

4．胰腺微環(huán)境誘導(dǎo)：損傷組織的特點和類型，是決定MSCs移植后是否能分化及分化方向的重要因素。近年研究證明在糖尿病疾病情況下，胰腺中存在著能誘導(dǎo)干/祖細(xì)胞分化為IPCs的微環(huán)境。

Choi等[21]模擬胰腺損傷的動物模型，先切除大鼠60%的胰腺，2 d后取胰腺制成勻漿，提取上清液加入到生長融合的MSCs的培養(yǎng)基中，1周后發(fā)現(xiàn)明顯提高M(jìn)SCs分化為IPCs的效率，細(xì)胞表達(dá)胰島素、胰高糖素、生長抑素、胰多肽的水平明顯升高，有葡萄糖刺激的胰島素分泌。Chang等[22]取糖尿病鼠胰腺組織碎片，整合到鎳包被的Cytodex3微載體中，與MSCs共同培養(yǎng)3～4周，觀察到MSCs形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，胰島樣細(xì)胞團(tuán)在高糖刺激下有胰島素分泌，表達(dá)C-肽、胰島素mRNA和蛋白，雙硫棕染色呈陽性。

有學(xué)者直接將MSCs移植到糖尿病鼠體內(nèi)，以糖尿病動物模型自身的胰腺微環(huán)境誘導(dǎo)MSCs分化為IPCs。Ianus等[23]將鼠類GFP標(biāo)記的骨髓細(xì)胞移植到C57BL/6鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞在胰島中出現(xiàn)，占受體胰島細(xì)胞的1.7%～3%，并能表達(dá)胰島素、GLUT2和典型的β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子。Dong等[24]用BrdU標(biāo)記MSCs移植治療大鼠糖尿病，胰腺中發(fā)現(xiàn)BrdU和胰島素雙染細(xì)胞，證實MSCs能在胰腺中分化為IPCs；楊亞麗等[25]移植EGFP標(biāo)記的MSCs至STZ誘導(dǎo)的糖尿病鼠胰腺包膜下，發(fā)現(xiàn)EGFP標(biāo)記細(xì)胞能長期存活，有EGFP和胰島素蛋白雙陽性細(xì)胞出現(xiàn)，雙陽性細(xì)胞能在局部形成胰島樣結(jié)構(gòu)，并見少量EGFP和PDX-1 mRNA雙陽性細(xì)胞；Wang等[26]取雄性GFP轉(zhuǎn)基因鼠的骨髓細(xì)胞移植入新生雌性NOD鼠體內(nèi)，2個月后在胰腺發(fā)現(xiàn)有移植的骨髓細(xì)胞，通過FISH發(fā)現(xiàn)胰島中有供體源性細(xì)胞表達(dá)胰島素，表明骨髓細(xì)胞在糖尿病鼠胰腺微環(huán)境中可以形成IPCs。

二、MSCs移植分化為IPCs的機(jī)制

通常認(rèn)為，MSCs有跨胚層橫向分化的能力，但目前此觀點面對的最大挑戰(zhàn)是干細(xì)胞與成體細(xì)胞融合的質(zhì)疑(圖1)。Terada、 Ying等[27-28]于2007年發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞與其他細(xì)胞的融合，之后有人提出所有跨系/橫向分化現(xiàn)象都是由于供體干細(xì)胞與受體組織細(xì)胞發(fā)生融合而表現(xiàn)出相應(yīng)的生物學(xué)特性；傳統(tǒng)觀點則認(rèn)為MSCs細(xì)胞基因組內(nèi)有多套程序調(diào)控細(xì)胞分化，在不同外界環(huán)境中細(xì)胞選擇性開啟一套特定程序，從而啟動MSCs定向分化成某種終末細(xì)胞。

1．融合：在探索成體干細(xì)胞可塑性的研究中發(fā)現(xiàn)一種新的現(xiàn)象——細(xì)胞融合。Terada等[27]將攜帶GFP和抗生素抗性基因的骨髓細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)，在有抗生素的培養(yǎng)條件下，幾周后產(chǎn)生少量的單個GFP陽性克隆,這些克隆在相應(yīng)的分化條件下有胚胎干細(xì)胞的多向潛能，并同時兼有骨髓細(xì)胞的抗生素抗性、表達(dá)GFP，這些克隆核型分析出現(xiàn)4倍體、6倍體和XXXY的染色體核型。Ying等[28]用神經(jīng)細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)，得到類似的結(jié)果。更多的人相信正是通過細(xì)胞融合機(jī)制使骨髓細(xì)胞/干細(xì)胞能在體內(nèi)分化為肝、心肌、神經(jīng)、脂肪等組織細(xì)胞，所謂橫向分化的證據(jù)實際上是細(xì)胞融合引發(fā)的假象，把橫向分化解釋為移植的干細(xì)胞與不同譜系的宿主細(xì)胞自發(fā)融合，導(dǎo)致遺傳信息轉(zhuǎn)移，因而形成的雜合細(xì)胞具有兩個親代細(xì)胞的特性，可以生成成體組織。

2．分化：Wang等[26]使用INS2-CRE雄性小鼠骨髓細(xì)胞移植至雌性ROSA-stoplox-EGFP轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)，若移植的骨髓干細(xì)胞與受體胰島細(xì)胞融合并分泌胰島素，會由CRE激活EGFP表達(dá)，實際上受體鼠體內(nèi)沒有EGFP陽性細(xì)胞，有力地證明移植的骨髓干細(xì)胞以細(xì)胞融合以外的方式分化為IPCs。楊亞麗等[25]發(fā)現(xiàn)，移植至STZ誘導(dǎo)的糖尿病鼠胰腺的MSCs能分化為IPCs，這些EGFP標(biāo)記的MSCs DNA倍性均為整2倍體和少量整4倍體，排除移植的MSCs與組織細(xì)胞融合的可能。

Moriscot等[29]發(fā)現(xiàn)，最初分離的MSCs表達(dá)OCT4，有很長的質(zhì)粒長度，OCT4是全能胚胎干細(xì)胞和生殖細(xì)胞的首要分子標(biāo)記，端粒的長度與細(xì)胞增殖能力有直接的關(guān)系，這提示MSCs具有分化的多能性。最近Colletti等[30]將hMSCs移植到胎羊體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞植入后25 h內(nèi)很快增殖和啟動分化，轉(zhuǎn)變成為肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肺組織細(xì)胞等細(xì)胞類型， FISH表明MSCs移植后沒有與組織細(xì)胞融合，主要通過分化來獲得新的表型。隨著研究的進(jìn)展，MSCs的分化潛能已經(jīng)衍生到多種外胚層和內(nèi)胚層的組織，MSCs的分化能力也會更深刻地被認(rèn)識。

三、展望

回顧過去的研究，MSCs用于糖尿病治療取得了令人歡欣鼓舞的成果，但是仍有許多問題需要解決：(1)需要明確MSCs治療1型糖尿病和分化為β細(xì)胞的機(jī)制；(2)MSCs長期體外擴(kuò)增以及體內(nèi)移植的安全性問題；(3)如何大規(guī)模的利用MSCs產(chǎn)生IPCs。隨著研究的進(jìn)一步深入和技術(shù)的提高，相信不久的將來，這些問題都會被逐一解決，使MSCs根治糖尿病成為可能。

[1] Summer R,Fine A.Mesenchymal progenitor cell research: limitations and recommendations.Proc Am Thorac Soc,2008,15,5:707-710.

[2] Abdallah BM,Kassem M.The use of mesenchymal (skeletal) stem cells for treatment of degenerative diseases:current status and future perspectives.J Cell Physiol,2009,218:9-12.

[3] Dezawa M,Kanno H,Hoshino M,et al.Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation.J Clin Invest,2004,113:1701-1710.

[4] Oh SH,Muzzonigro TM,Bae SH,et al.Adult bone marrow-derived cells trans-differentiating into insulinproducing cells for treatment of type I diabetes.Lab Invest,2004,84:607-617.

[5] Chen LB,Jiang XB,Yang L.Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta cells.World J Gastroenterol,2004,10:3016-3020.

[6] Notkins AL,Lernmark A.Autoimmune type 1 diabetes: resolved and unresolved issues.J Clin Invest,2001,108:1247-1252.

[7] Sun Y,Chen L,Hou XG,et al.Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from diabetic patients into insulin-producing cells in vitro.Chin Med J (Engl),2007,120:771-776.

[8] Timper K,Seboek D,Eberhardt M,et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin, somatostatin, and glucagons-expressing cells.Biochem Biophys Res Commun,2006,341:1135-1140.

[9] Eberhardt M,Salmon P,von Mach MA,et al.Multipotential nestin and Isl-1 positive mesenchymal stem cells isolated from human pancreatic islets.Biochem Biophys Res Commun,2006,345:1167-1176.

[10] Pessina A,Eletti B,Croera C,et al.Pancreas developing markers expressed on human mononucleated umbilical cord blood cells.Biochem Biophys Res Commun,2004,323:315-322.

[11] Chao KC,Chao KF,Fu YS,et al.Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton′s jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes.PLoS One,2008,3:e1451.

[12] Davani B,Ikonomou L,Raaka BM,et al.Human islet-derived precursor cells are mesenchymal stromal cells that differentiate and mature to hormone-expressing cells in vivo.Stem Cells,2007,25:3215-3222.

[13] Baertschiger RM,Bosco D,Morel P,et al.Mesenchymal stem cells derived from human exocrine pancreas express transcription factors implicated in beta-cell development.Pancreas,2008,37:75-84.

[14] Lu Y,Wang Z,Zhu M.Human bone marrow mesenchymal stem cells transfected with human insulin genes can secrete insulin stably.Ann Clin Lab Sci,2006,36:127-136.

[15] Li Y,Zhang R,Qiao H,et al.Generation of insulin-producing cells from PDX-1 gene-modified human mesenchymal stem cells.J Cell Physiol,2007,211:36-44.

[16] Li L,Li F,Qi H,et al.Coexpression of Pdx1 and betacellulin in mesenchymal stem cells could promote the differentiation of nestin-positive epithelium-like progenitors and pancreatic islet-like spheroids.Stem Cells Dev,2008,17:815-823.

[17] Noguchi H,Kaneto H,Weir GC,et al.PDX-1 protein containing its own antennapedia-like protein transduction domain can transduce pancreatic duct and islet cells.Diabetes,2003,52:1732-1737.

[18] Noguchi H,Bonner-Weir S,Wei FY,et al.BETA2/NeuroD protein can be transduced into cells due to an arginine-and lysinerich sequence.Diabetes,2005,54:2859-2866.

[19] Domínguez-Bendala J,Klein D,Ribeiro M,et al.TAT-mediated neurogenin 3 protein transduction stimulates pancreatic endocrine differentiation in vitro.Diabetes,2005,54:720-726.

[20] Kilk K,Magzoub M,Pooga M,et al.Cellular internalization of a cargo complex with a novel peptide derived from the third helix of the islet-1 homeodomain.Comparison with the penetratin peptide.Bioconjug Chem,2001,12:911-916.

[21] Choi KS,Shin JS,Lee JJ,et al.In vitro trans-differentiation of rat mesenchymal cells into insulin-producing cells by rat pancreatic extract.Biochem Biophys Res Commun,2005,330:1299-1305.

[22] Chang C,Niu D,Zhou H,et al.Mesenchymal stem cells contribute to insulin-producing cells upon microenvironmental manipulation in vitro.Transplant Proc,2007,39:3363-3368.

[23] Lanus A,Holz GG,Theise ND,et al.In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion.J Clin Invest,2003,111: 843-850.

[24] Dong QY,Chen L,Gao GQ,et al.Allogeneic diabetic mesenchymal stem cells transplantation in streptozotocin-induced diabetic rat.Clin Invest Med,2008,31:328-337.

[25] 楊亞麗,齊暉,李富榮,等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入糖尿病大鼠胰腺后的分化及對血糖的影響.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2009，29:584-588.

[26] Wang X,Ge S,Gonzalez I,et al.Formation of pancreatic duct epithelium from bone marrow during neonatal development.Stem Cells,2006,24: 307-314.

[27] Terada N,Hamazaki T,Oka M,et al.Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion.Nature,2002, 416:542-545.

[28] Ying QL，Nichols J，Evans EP，et al.Changing potency by spontaneous fusion．Nature,2002,416:545-548．

[29] Moriscot C,de Fraipont F,Richard MJ,et al.Human bone marrow mesenchymal stem cells can express insulin and key transcription factors of the endocrine pancreas developmental pathway upon genetic and/or microenvironmental manipulation in vitro.Stem Cells,2005,23:594-603.

[30] Colletti EJ,Airey JA,Liu W,et al.Generation of tissue-specific cells from MSC does not require fusion or donor-to-host mitochondrial/membrane transfer.Stem Cell Res,2009,2:125-138.

2009-08-31)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.029

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