姚旺祥 馬 安

(1.杭州市第一人民醫(yī)院,浙江 杭州 310006;2.浙江省醫(yī)學科學院,浙江 杭州 310013)

因創(chuàng)傷、腫瘤所致的骨缺損、骨不連的治療一直是骨科研究的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的自體骨移植由于其來源有限且增加創(chuàng)傷使其應用受到一定的局限,單純使用同種異體骨及人工骨則有成骨能力受限、費用高等缺點[1]。骨組織工程的發(fā)展為解決問題帶來了新的希望。使用體外培養(yǎng)的細胞有培養(yǎng)時間長、難以及時使用等缺點,而若通過濃縮骨髓基質(zhì)干細胞,則可以及時獲得治療濃度的細胞,一次操作解決問題[2]。應用臨床廣泛使用的纖維蛋白膠作為支架,具有便宜、易得等優(yōu)點,且可有效解決細胞的流失問題,為成骨提供支架而促進成骨。本文就自體骨髓與纖維蛋白膠在骨組織工程中的應用現(xiàn)狀作一綜述。

1 自體骨髓的應用現(xiàn)狀

1.1 自體骨髓的主要成分 骨髓位于骨髓腔中,胎兒及嬰幼兒時期的骨髓都是紅骨髓,成人紅骨髓都分布在扁骨,不規(guī)則骨及長骨干骺端的松質(zhì)骨中。紅骨髓主要是由造血組織與血竇構(gòu)成。骨髓是由造血系統(tǒng)和基質(zhì)系統(tǒng)組成的復合組織。一系列的實驗結(jié)果證實了骨髓基質(zhì)細胞系統(tǒng)中存在能夠分化為骨、軟骨、脂肪組織的多能干細胞,其在合適的條件下可以生成骨、軟骨、肌肉和脂肪及韌帶[3]。

松質(zhì)骨主要由骨髓中的成骨干細胞分化而來,骨髓的成骨能力早就被應用到促進骨折愈合中來,例如在異體骨移植時混合在術(shù)中獲得的骨髓來增加移植骨的成骨特性[4]。動物實驗證明,骨髓中富含骨形成蛋白、基質(zhì)細胞、骨內(nèi)膜細胞和骨祖細胞等成分。骨髓中的單核細胞及血小板等能產(chǎn)生各種生長因子,促進骨缺損的修復[5]。

骨髓的成骨能力主要由骨髓基質(zhì)細胞完成,而骨髓基質(zhì)細胞具備干細胞的兩個重要特征:強的自我增殖能力和多向分化潛能,具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉(心肌)及神經(jīng)細胞等組織分化的潛能[6]。骨髓的成骨能力與骨髓中基質(zhì)細胞的濃度存在正相關(guān),且隨著年齡的增長,骨髓基質(zhì)細胞的成骨活性有所降低[7]。

1.2 自體骨髓在骨組織工程中的應用 近年來已有自體骨髓移植的臨床報道,它具有來源廣泛、創(chuàng)傷小、采取方便、不受骨不連部位軟組織條件的限制、不存在免疫反應、供區(qū)與受區(qū)并發(fā)癥少等優(yōu)點[8]。Finkemeier等[9]觀察到骨髓基質(zhì)細胞可直接轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌毎?。在誘導因子和刺激因子存在的情況下,其他器官組織干細胞亦可轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌毎?因此,骨髓不僅本身有成骨作用,還可誘導刺激骨不連處其他器官組織細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌毎?大大提高了局部成骨能力。

Bruder等[10]采集大鼠、犬和人骨髓中的骨髓基質(zhì)細胞在體外培養(yǎng)擴增后,種植于羥基磷灰石和磷酸三鈣支架材料,復合后分別將其植入同基因的鼠、犬和去胸腺大鼠體內(nèi),成功地修復了標準的股骨干骨缺損。Owen等[11]將骨髓細胞懸液種入擴散盒,植入動物體內(nèi),發(fā)現(xiàn)有骨形成,由于擴散盒能夠阻擋植入部位周圍細胞及血管的長入,故其成骨作用不依賴于周圍組織。擴散盒的組織由纖維組織向軟骨組織和骨組織轉(zhuǎn)變,與胚胎骨發(fā)生過程十分相似。以上研究結(jié)果證明了骨髓中存在著不依賴于原有骨髓環(huán)境,能夠獨立成骨的骨祖細胞成分。

1.3 自體骨髓及其提取物在臨床的應用 Quarto等[12]報道采用自體髂骨穿刺抽取骨髓,分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞,經(jīng)體外擴增后復合羥基磷灰石修復3例四肢長骨缺損,采用外固定支架固定。經(jīng)術(shù)后隨訪,1例右脛骨4.0cm的缺損在術(shù)后27個月、1例右尺骨遠端4.0cm缺損在術(shù)后16個月、1例右肱骨7.0cm缺損在術(shù)后15個月時均獲得功能恢復。柴崗等[13]利用骨髓基質(zhì)細胞體外誘導為成骨細胞后,與同種異體部分脫鈣骨復合修復顱頜面骨缺損病11例,術(shù)后1～2.5年的隨訪表明組織工程骨穩(wěn)定存在,無明顯骨吸收現(xiàn)象,臨床治療效果穩(wěn)定。

Connolly等[7]報道用自體骨髓注射成功治療20例脛骨骨不連,證實了自體骨髓的成骨作用。Hernigou等[14]將自體骨髓通過細胞分離器濃縮后注射入脛骨萎縮性骨不連患者,證明其有效性與移植骨髓中基質(zhì)細胞的數(shù)量有關(guān),不經(jīng)濃縮處理,其基質(zhì)細胞數(shù)量并不能達到治療骨不連的理想數(shù)目。干耀愷等[15]利用富集骨髓基質(zhì)細胞技術(shù),通過局部注射或與多孔磷酸三鈣材料復合后回植治療骨缺損患者49例,證實富集骨髓干細胞技術(shù)是一種快速、安全、簡便的臨床細胞治療手段。這些研究表明,骨髓基質(zhì)細胞復合適宜材料進行移植可修復骨缺損,骨髓基質(zhì)細胞復合材料的成骨能力明顯優(yōu)于單用材料或單用骨髓基質(zhì)細胞,因為材料提供細胞生長的支架而不讓其流失[16]。

在臨床工作中,使用骨髓基質(zhì)細胞應嚴格遵守細胞移植治療的適應證及禁忌證,遵守我國《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范(2003)》制定的全部準則,謹慎地在較大型的三級甲等醫(yī)院,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意,進行臨床實驗,為廣大患者服務。

2 纖維蛋白膠在臨床及組織工程技術(shù)中的應用

2.1 纖維蛋白膠的主要成分及理化性質(zhì) 纖維蛋白膠(Fibrin Glue,FG)是利用哺乳類動物或人的血液中有關(guān)成分,通過人工提取而來。FG由兩部分組成,第一部分為濃縮纖維蛋白原、XIII因子和抑肽酶,其中纖維蛋白原含量與凝固的強度、凝固時間直接相關(guān),而XlII因子可以促進未分化的間充質(zhì)干細胞的增殖及分化;第二部分含凝血酶和氯化鈣。兩者混合后凝血酶酶切纖維蛋白原,釋放出纖維蛋白A肽及B肽,促進纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白,形成纖維蛋白單體,凝血因子使纖維蛋白分子交聯(lián),聚合成網(wǎng)狀,增加凝集強度。凝血酶在鈣離子存在下參與纖維蛋白多肽的交聯(lián),使之形成堅固的不易降解的凝塊[17]。

在體內(nèi)纖溶酶作用下,通常纖維蛋白在體內(nèi)的降解時間在2～3周左右[18]。纖維蛋白膠內(nèi)不同的組成成分,如纖維蛋白原、凝血酶的濃度、離子強度等都能夠影響纖維蛋白膠的穩(wěn)定性及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。堵疾等[19]研究發(fā)現(xiàn),通過在FG中加入不同濃度抑肽酶、氨基酸類化合物,可以調(diào)節(jié)控制其降解時間。氨基酸類化合物抗纖溶作用機制主要是抑制纖溶酶原與纖維蛋白的結(jié)合,由于氨基酸類化合物結(jié)構(gòu)與賴氨酸相似,從而競爭性抑制了纖溶酶原與纖維蛋白的結(jié)合,影響其激活,使之不受纖溶作用而溶解;此外,此類氨基酸類化合物也抑制了纖溶酶活性的作用,保護某些凝血因子,免受纖溶酶的降解。

纖維蛋白在創(chuàng)傷愈合中是一種天然的細胞生長支架材料,從創(chuàng)傷開始發(fā)生凝血、纖維蛋白支架形成后就開始為多種細胞,如成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞和內(nèi)皮細胞提供遷移至創(chuàng)傷部位的途徑[20]。在整個創(chuàng)傷愈合過程中,纖維蛋白不僅是支架材料,還有許多生物活性功能,如吸引和激活血細胞、促進血小板黏附等。

FG有良好的組織相容性,生物降解性,能較好地介導細胞信號傳導和細胞間相互作用,可降解并釋放β轉(zhuǎn)化因子和血小板衍生生長因子促進細胞粘附和增殖,為細胞提供三維空間,促進組織再生[21]。天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),長期穩(wěn)定的纖維蛋白膠是細胞生長和分泌特異性基質(zhì)的必要條件。如果纖維蛋白膠降解吸收過快或其纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過于緊密則會抑制細胞增殖與遷移,影響細胞外基質(zhì)的形成。

2.2 纖維蛋白膠在骨組織工程中的應用 現(xiàn)已廣泛用于外科臨床的PG是從全血中分別提取出纖維蛋白原和凝血酶后分開包裝的一種可注射型制劑。使用時將兩者混合注入機體內(nèi)。纖維蛋白膠可用于減少根治性乳房切除術(shù)和腫塊切除術(shù)后血腫的形成,同時該制劑可用于粘合手術(shù)縫合處。纖維蛋白膠在歐洲的臨床應用指癥是止血、組織粘合、促進縫合創(chuàng)口的愈合、封閉體內(nèi)空腔和蛛網(wǎng)膜下隙等[17]。

研究發(fā)現(xiàn)FG不僅具有封閉創(chuàng)面、止血、促進愈合、生物粘合等多種功能,還因其特有的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使其可作為藥物緩釋載體[22]。FG作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白的載體進行骨缺損修復研究發(fā)現(xiàn),兩者復合物的骨修復能力明顯大于單一成分[23]。Naif等[24]的研究證實FG能增加骨髓基質(zhì)細胞的黏附率并顯著促進其增殖。由于纖維蛋白膠在成型之前兩種成分都是液體成分,具有可以任意塑型的特點,聚合后通過凝膠狀纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)特點發(fā)揮支架作用,作為一種可注射性細胞支架材料目前已經(jīng)在組織工程學領域得到廣泛應用[25]。

FG本身也是一種優(yōu)良的骨修復材料,凝固后獨特的三維結(jié)構(gòu)使其為細胞的黏附提供了支架。Pei等[26]取自體膝關(guān)節(jié)滑膜細胞與纖維蛋白膠復合后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1個月,見細胞保持原有形態(tài),將其與材料復合后成功修復了兔股骨髁的骨軟骨缺損。Tayapongsak等[27]在下頜骨重建術(shù)中,將患者自體纖維蛋白黏合劑注入到骨移植區(qū),發(fā)現(xiàn)骨修復速度明顯加快。Isogai等[28]將培養(yǎng)后的牛骨膜細胞與FG混合植入裸鼠背部皮下,12周時有新骨形成,而單純FG植入無新骨形成。

Abiraman等[29]的實驗進一步證實FG可能有骨誘導活性,他們將PG包被羥基磷灰石顆粒,生物活性玻璃陶瓷和磷酸鈣硅酸鈣系統(tǒng)分別植入鼠股四頭肌,以未包被材料作為對照,結(jié)果表明FG可能有骨誘導作用。纖維蛋白膠的降解作用有利于組織的愈合,復合的細胞及細胞因子的釋放,從而與成骨同步起來[30]。另外FG可以促進形成新的毛細血管及膠原沉積,這也將有利于骨形成[31]。

總之,濃縮自體骨髓含有成骨細胞、豐富的成骨因子,可及時使用,而纖維蛋白膠則可提供細胞附著的支架,將兩者結(jié)合,可望為骨缺損的治療提供新的思路。

[1] Philippe Hernigoth,Sebastien Zilber,Paolo Filippini,et al.Bone Marrow Injection in Hip Osteonecrosis,Techniques in Orthopaedics,2008,23(1):18

[2] Gupta M C,Theerajunyapom T,Maitra S,et al.Efficacy of Mesenchymal StemCell Enriched Grafts in anOvine Posterolateral Lumbar Spine Model.Spine,2007,32(7):720

[3] Pittenger M F,Mackay A M,Beck S C,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science,1999,284:143

[4] Tadokoro M,Kanai R,Taketani T,New bone formation by allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in a patient with perinatal hypophosphatasia.J Pediatr,2009,154(6):924

[5] Chang S C,Tai C L,Chung H Y,et al.Bone marrow mescnchymal stem cells for m ectopic woven bone in vivo through endochoodral bonne,formation.Artif Organs,2009,33(4):301

[6] Lee K B,Hui J H,Song J C,et al.Injectable Mesenchymal Stem Cell Therapy for Large Cartilage Defects-A Porcine Model.Stem Cells,2007,26(7):44

[7] Connolly J F,Guse R,Tiedeman J,et al.Autologous marrow injection as a substitute foroperative graining of tibial nonunions.Clm Orthop Relat Res,1991,266(4):259

[8] Schliephake H,Zghoul N,J?ger V,et al.Bone formation in trabecular bone cell seeded scaffolds used for reconstruction of the rat mandible.Int J Oral Maxillofac Surg,2009,38(2):166

[9] Finkemeier C G,Michael W C.Treatment of femoral diaphyseal nonunions.Clin Ortho,2002,398:223

[10]Bruder S P,Fox B S.Tissue engineering of bone:cell based strategies.Clin orthop,1999,367(Suppl):S68

[11]Owen M.Marrow stromal stem cells.J Cell Sci,1998,10:63

[12]Quarto R,Mastrogiacoma M,Cancedda R.Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells.N Engl J Med,2001,344:385

[13]柴崗,張艷,劉偉,等.組織工程骨在顱頜面骨缺損臨床修復中的應用.中華醫(yī)學雜志,2003,83(19):1676

[14]Hermigou P H,Poignard A,Beaujean F,et al.Percutaneons autologous bone-marrow grafting for nonunion.Journal of Bone and Joint Surgery,2005,87(7):1430

[15]干耀愷,戴克戎,張蒲,等.應用富集骨髓干細胞技術(shù)治療骨缺損.中華骨科雜志,2006,26(11):721

[16]姚旺祥,裴國獻,劉勇,等.神經(jīng)植入對大段組織工程骨成骨影響的早期社驗研究.中華骨科雜志,2008,28(3):234

[17]Abiraman S,Varma H K,Umashankar P R,et al.Fibrin glue as an osteoinductive protein in a mouse model.Biomaterials,2002,23(14):3023

[18]Le-Nihouannen D,Le-Guehennec L,Bouillon T,et al.Microarchitecture of calcinm phosphate granules and fibrin glue composites for bone tissue engineering.J Biomaterial,2006,27:2716

[19]堵疾.纖維蛋白膠成膠后37℃維持時間的實驗.包頭醫(yī)學院學報,2002,18(1):7

[20]Tamer A E Ahmed,Emma V Dare,Max Hincke.Fibrin:a versatile scaffold for tissue engineering applications.Tissue Engineering Part B.Reviews,2008,14(2):199

[21]Von Arx T,Cochran D L,Hermann J S,et al.Lateral ridge augmentation and implant placement:an experimental study evaluating implant osseo integration in different augmentation materials in the canine mandible.Iht J Oral Maxillofac Implants,2001,16(3):343

[22]Schillinger U,Wexel G,Hacker C,et al.A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors,Pharm Res,2008,25(12):2946

[23]Minamide A,Yoshida M K,awakami M Y,et al.The use of cultured bone marrow cells in type I collagen gel and porous hydroxyapatite for posterolateral lumbar spine fusion.Spine,2005,30(10):1134

[24]Naif M B,Varma HK,John A.Platelet-rich plasma and fibrin gluecoated bioactive ceramics enhance growth and differentiation of goat bone marrow-derived stem cells.Tissue Eng Part A,2009,15(7):1619

[25] Yasuda H,Kuroda S,Shichinohe H,et al.Effect of biodegradable fibrin scaffold on survival,migration,and differentiation of transplanted bone marrow stromal cells after cortical injury in rats,J Neurosurg,2010,112(2):336

[26]Pei M,He F,Boyce B M,et al.Repair of full-thickness femoral condyle cartilage defects using allogeneic synovial cell-engineered tissue constructs.Osteoarthritis Cartilage,2009,17(6):714

[27]Tayapongsak P,O'Brien D A,Monteiro C B,et al.Autologous fibrin adhesive in mandibular reconstruction with particulate cancellous bone and marrow.J Oral Maxill of Surg,1994,52(2):161

[28]Isogai N,Landis W J,Mori R.Experimental use of fibrin glue to induce site-directed osteogenesis from cultured periosteal cells.Plast ReconstrSurg,2000,105(3):953

[29]Abiraman S,Varma H K,Umashankar P R,et al.Fibrin glue as an osteoinductive protein in a mouse model.Biomaterials,2002,23(14):3023

[30]Itosaka H,Kuroda S,Shichinohe H,et al.Fibrin matrix provides a suitable scaffold for bone marrow stromal cells transplanted into injured spinal cord:A novel material for CNS tissue engineering.Neuropathology,2008,29(3):248

[31]Ornelas L,Padilla L,Di Silvio M,et al.Fibrin glue an alternative technique for nerve coaptation-Part I.Wave amphtude,conduction velocity,and plantar-length factors.J Reconstr Microsurg,2006,22(2):119