張曉艷 綜述 趙順英 江載芳 審校

近年來由于造血干細胞、實體器官移植的廣泛開展、高強度免疫抑制劑和大劑量化療藥物的應用，以及各種導管的體內介入、留置等，臨床上侵襲性真菌感染(IFI)的發(fā)生率和病死率呈明顯上升趨勢，其預后改善有賴于早期診斷和及時有效的抗真菌治療。然而由于IFI的臨床表現不典型且易被原發(fā)病掩蓋，致使早期診斷十分困難。真菌培養(yǎng)和組織活檢是IFI診斷的金標準，然而由于所需時間長、敏感度較低以及有時因患者的病情而難以獲得組織標本，無法滿足臨床診斷的需要。近年來開展的真菌抗原檢測，尤其是半乳甘露聚糖(galactomanna,GM)和1,3-β-D葡聚糖(BG)檢測作為一種非侵襲性診斷方法，有著早期、快速、高靈敏度和特異度的優(yōu)點，先后被歐洲國家、美國及中國制定的IFI診斷和治療指南列為臨床診斷IFI的微生物學標準之一。本文就真菌抗原檢測在IFI中的診斷價值做一綜述。

1 GM

GM是曲霉菌細胞壁上的一種多糖抗原。Latgé等[1]從體外曲霉菌培養(yǎng)的上清液提取分析了GM的結構，GM在體外是一種單純多糖，相對分子質量約為20 000，其共有結構是由α-1，2和α-1，6糖苷鍵聚合而成的甘露聚糖核心及由β-1，5呋喃半乳糖殘基組成的具有抗原活性的側鏈構成。GM的抗原表位為其側鏈上的β-1，5半乳呋喃糖，GM的抗原表位數目在不同的曲霉菌株和菌種有所不同。

GM在曲霉菌絲向組織侵襲性生長時釋放進入血液循環(huán)，這種抗原血癥可持續(xù)存在1～8周[2]。已有的商品化試劑盒采用乳膠凝集法(LA)和ELISA法檢測GM，兩者均使用抗GM單克隆抗體,但由于實驗方法不同,其敏感度和特異度存在較大差異。LA可檢測出血清中GM 15 μg·L-1，而此時患者已生命垂危，開始治療意義不大[3～5]，因此限制了其臨床應用。20世紀90年代初發(fā)展的ELISA法，利用鼠抗GM單克隆抗體檢測循環(huán)中的GM，其靈敏度達0.5～1 μg·L-1。Maertens等[6]關于ELISA檢測血清GM對血液病患者IFI診斷價值的研究結果顯示，若以2次吸光度指數≥1.0為陽性判定界值點，實驗總敏感度為92.6%，特異度為95.4%，陽性預測值和陰性預測值分別為93%和95%，50%以上患者在出現臨床癥狀前即可檢出血中抗原。對高危患者進行動態(tài)檢測(每周2次)更具有早期診斷價值。2003年，美國FDA完成對該實驗的臨床評價, 其敏感度為80.7%,特異度為89.2%,早期診斷優(yōu)勢突出，并批準GM實驗用于非免疫缺陷患兒侵襲性曲霉菌病(IA)的輔助診斷。

近年將ELISA檢測血清GM與胸部CT結合作為搶先治療的起點，不僅降低了病死率，同時提高了診斷IA的準確性，減少了過度經驗性用藥的毒性作用和費用[7，8]。多項研究顯示，血清GM水平與組織的真菌負荷量成正比，動態(tài)監(jiān)測血清GM水平的變化有助于判斷抗真菌治療的效果[2，6，9，10]。需要注意的是，有文獻報道在使用棘白菌素類的抗真菌藥治療后，臨床癥狀改善并不一定伴有血清GM滴度的下降[11]。在兔IPA模型中，Francesconi等[12]發(fā)現三唑類抗真菌藥可顯著降低支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的GM水平，而使用棘白菌素類藥物治療組BALF中的GM水平則持續(xù)升高，考慮可能與棘白菌素類藥破壞真菌的細胞壁而不能將其徹底清除，使其胞壁抗原不斷釋放入周圍組織中有關。

至今，關于ELISA檢測血清GM在IA中診斷價值的研究結果均顯示了較高的特異度(>85%)，然而敏感度差異較大(30%～100%)[13～20]。

被檢人群的不同，感染的曲霉菌種以及實驗相關的因素等均可對實驗結果產生不同程度的影響。晚近，Pfeiffer等[21]對ELISA檢測血清GM在IA中的診斷價值進行Meta分析，發(fā)現該實驗在惡性血液病患者中的敏感度和特異度分別為70%和92%，然而在實體器官移植患者中的敏感度僅為22%，提示GM實驗在惡性血液病或骨髓移植患者中的診斷價值優(yōu)于實體器官移植患者。Balloy等[22]對由糖皮質激素和化療藥所致的免疫抑制IA小鼠進行研究，發(fā)現由糖皮質激素所致免疫抑制的小鼠，在其感染的肺組織伴有快速和大量的中性粒細胞浸潤，肺、腎和腦組織中GM水平較低；化療藥所致免疫抑制小鼠的BALF中出現了大量的菌絲浸潤和GM水平的顯著升高(無多核細胞的浸潤)，提示被測鼠群的不同，可顯著影響實驗的敏感度。

假陰性結果除與上述被測鼠群不同有關外，還與以下因素有關： ①判斷陽性結果的界值點：起初歐洲國家多以1.5作為陽性判定界值點，Bio-Rod公司推薦的判定界值點也為1.5。美國FDA推薦的判定界值點為0.5。Ulusakarya等[13]以1.5作為陽性判定界值點，實驗的敏感度和特異度分別為69%和96%，若將陽性界值點降至1.0則實驗的敏感度可升至100%，而特異度降至92%。為確定一個最佳陽性界值點，Verweij等[23]對203例患者進行了檢測，受試工作者特征(ROC)曲線分析結果顯示，陽性界值點為0.5時的敏感度為97.4%，特異度為90.5%，陽性預測值和陰性預測值分別為66.1%和99.4%。目前以0.5為判定界值點已被歐洲國家和美國普遍接受。②宿主抗真菌治療：Marr等[24]對67例患者的986份血清進行GM實驗，顯示在未接受抗真菌治療患者的敏感度為80%，而經抗真菌治療患者的敏感度僅為20%。 ③還可能與曲霉菌感染的嚴重程度、高滴度抗體和一過性抗原血癥有關。文獻報道在非侵襲性或侵襲程度較低的肺曲霉菌病(如曲霉球和氣管支氣管曲霉菌病)ELISA檢測血清GM的敏感度較低，在慢性空洞性肺曲霉病患者血清ELISA GM檢測的臨床意義不大[25]。因真菌抗原血癥是一過性的，樣本采集頻率較低，可能會降低實驗的敏感度。目前推薦對高?；颊呙恐軝z測2次。在可疑IA患者的敏感度一般較低，可使實驗總的敏感度降低[16，26]。

血清GM檢測對IA的診斷有較好的特異度，但有文獻報道在兒童，尤其是小嬰兒和新生兒的假陽性率則較高。一項包含成人和兒童的前瞻性研究顯示，兒童的假陽性率為10.1%(34/338例),成人僅為2.5%(10/406例)[27]。另外一項研究同樣顯示，兒童的假陽性率顯著高于成人(44%vs0.9%)[26]。Siemann等[28]對6例新生兒進行GM實驗，其中5例呈假陽性結果。關于兒童中假陽性率較高的原因可能與嬰兒或新生兒腸道內定植著大量的雙歧桿菌有關，雙歧桿菌的脂膜酸可與GM發(fā)生交叉反應；另外配方奶中含有較高濃度的GM，可能與通過尚未發(fā)育完整的腸黏膜進入循環(huán)而造成假陽性結果[29]。谷物、谷類食品和牛奶等食物中均含有GM，可通過受損的腸黏膜進入循環(huán)引起抗原血癥，也可解釋骨髓移植患者血清 ELISA GM檢測的假陽性率在移植術后的第1個月最高，因為這一時期化療藥所致的腸黏膜病變最為嚴重[26]。靜脈應用β-內酰胺類抗生素也可產生假陽性結果[30～32]，最近一項研究對15種抗生素進行了檢測，結果顯示氨芐西林的吸光度指數最高(0.54)，其次為哌拉西林-三唑巴坦(0.235)。除曲霉菌外，在其他真菌，尤其是青霉菌屬的生長過程中也伴有GM的釋放。在細菌感染患者也可出現假陽性結果，但相關機制尚不清楚，可能與抗生素的使用有關，而且目前尚未發(fā)現假陽性結果與何種細菌感染之間存在必然的相關性[33,34]。

2 BG

BG占真菌胞壁成分的50%以上，由D-葡聚糖聚合而成，以β-1，3糖苷鍵連接的葡萄糖殘基骨架作為主鏈,分支狀β-1，6糖苷鍵連接的葡萄糖殘基作為側鏈。除結合菌(主要是根霉菌和毛霉菌)外,所有真菌胞壁成分中都含有BG，以酵母樣真菌含量最高,而其他微生物、動物及人的細胞成分和細胞外液都不含BG。BG在真菌感染中的作用,可能與內毒素在革蘭陰性桿菌感染中的作用類似,可刺激機體產生免疫反應，并被迅速清除。當真菌進入血液或深部組織后,經吞噬細胞的吞噬和消化等作用后,BG可從真菌細胞壁釋放，從而使血液及其他體液(如尿液、腦脊液、腹水和胸水等) 中的含量升高。當真菌減少時,機體免疫系統(tǒng)將其迅速清除，而在淺部真菌感染時則無類似現象[35]。因此血漿BG水平升高已成為IFI的一個重要指標。

20世紀90年代初發(fā)現，馬蹄鱟(主要是東方鱟和美洲鱟)凝血系統(tǒng)中的凝血酶原G因子能識別BG，是BG的天然檢測者。BG與G因子的α亞基特異性結合后可激活β亞基，從而旁路激活鱟實驗(內毒素主要激活的是鱟的凝血酶原C因子)此過程即為G實驗。

目前市場上常用的試劑盒主要有兩種，日本的Fungitec-G glucan試劑和美國的Glucatell試劑。Fungitec-G glucan試劑主要成分是東方鱟的細胞裂解產物，其判斷標準為20 ng·L-1；而Glucatell試劑則使用了美洲鱟的細胞裂解產物作為主要原料，其判斷標準的爭議較多，目前推薦使用的判斷標準為60 ng·L-1。

Obayashi等[36]研究G實驗在真菌感染和真菌性發(fā)熱中的診斷價值，檢測了202例標本，100例有明確感染菌的患者中，37/41例(90%)確診真菌感染患者中G實驗陽性,59例其他原因所致的發(fā)熱患者G實驗均陰性；26/102例不明原因發(fā)熱患者G實驗陽性；將陽性結果判斷為真菌感染，則真菌感染判斷的陽性率為59%,陰性率為97%，有效率為85%。Ostrosky-Zeichner 等[37]對170名健康志愿者和163例確診或可疑深部真菌感染患者進行了檢測，結果顯示以≥60 ng·L-1為陽性判定界值點,其總敏感度為69.9%,特異度為87.1%,陽性預測值為83.5%，陰性預測值為75.1%；深部念珠菌感染患者中的陽性率為81.3%，曲霉菌感染患者中的陽性率為80%，隱球菌感染患者中的陽性率為25%，毛霉菌和根霉菌感染患者檢測結果均為陰性。Odabasi等[38]檢測283例急性白血病或骨髓增生異常綜合征患者不同時間點的血標本(在3周內每例患者平均采集7次)，結果顯示以≥60 ng·L-1為陽性判定界值點，實驗的敏感度和特異度分別為97%和90%～96%，陰性預測值為100%；所有真菌定植患者血漿BG水平均無顯著升高；所有確診或高度可疑IFI患者在出現明顯的臨床癥狀前，至少有1次G實驗為陽性，同時血清GM水平的變化有助于判斷抗真菌治療的效果。

G實驗可作為IFI的一種有效篩查方法，具有早期診斷價值。目前主要用于侵襲性念珠菌、曲霉菌感染高危人群的監(jiān)測及療效和預后的評估。其不足之處在于：①陽性結果只表示IFI，而不能確定是何種真菌；②不適用于結合菌和隱球菌感染的診斷，因根霉菌和毛霉菌胞壁中不含BG，隱球菌的胞壁中含量較少，且具有厚壁莢膜，不利于吞噬細胞的吞噬及抗原的釋放[37，39]；③白蛋白、丙種球蛋白、香菇多糖、磺胺類藥物及血液透析等均可導致假陽性結果。由于BG也存在于植物胞壁中，故纖維素類物質的使用可導致假陽性結果(如手術中使用的紗布和血液透析時使用的某些纖維素制品)。輸注白蛋白和IVIG導致的G實驗假陽性可能與在血液制品的加工過程中使用的纖維素薄膜過濾器有關[39～42]。

G實驗和ELISA檢測血清GM均可用于IA的診斷。Pazos 等[43]對40例中性細胞減少的IFI高?；颊咄瑫r進行了G實驗和ELISA檢測血清GM, 結果顯示兩者的敏感度和特異度差異無統(tǒng)計學意義，但發(fā)現G實驗有先于ELISA檢測血清GM陽性的傾向，同時檢測有助于識別假陽性,可將特異度提高至100%。

3 隱球菌莢膜多糖抗原

隱球菌的莢膜由多糖構成,利用LA檢測隱球菌莢膜多糖抗原是目前臨床上診斷隱球菌感染的最重要方法之一，已被廣泛應用。

Bloomfild等[44]首先采用LA檢測血清和腦脊液中的隱球菌莢膜多糖抗原，其生化原理是抗隱球菌蛋白與隱球菌莢膜多糖抗原反應可引起明顯的凝集現象，與正常蛋白則不引起凝集。目前國內外報道LA的敏感度為93%～100%,特異度為93%～98%,由于采用試劑盒不同,結果存在一定差異[45]。Antinori等[46]對多個國家以往隱球菌抗原檢測的報道進行綜合評價，隱球菌抗原檢測腦脊液中的陽性率為94.1%，在血清中的陽性率為93.6%；在不同的免疫宿主人群中，隱球菌抗原檢測的敏感度稍有差異。在HIV陽性的隱球菌腦膜炎患者中，血清和腦脊液中隱球菌抗原檢測的陽性率分別為98.9%和92.2%；在HIV陰性的其他免疫功能缺陷的隱球菌腦膜炎患者中，血清和腦脊液中隱球菌抗原檢測的陽性率分別為87.2%和97.7%；在免疫功能正常的隱球菌腦膜炎患者中，血清和腦脊液中隱球菌抗原檢測的陽性率分別為92.3%和98.9%。

多項研究顯示，經有效抗真菌治療后，臨床癥狀改善常伴有莢膜多糖抗原滴度的下降，而病情加重或復發(fā)患者則有滴度上升，因此利用LA檢測隱球菌的莢膜多糖抗原不僅有助于早期診斷，還可用于療效和預后的評估[47,48]。對于莢膜多糖抗原陽性的患者，經有效治療后,真菌培養(yǎng)和涂片轉陰，抗原滴度呈下降趨勢，但需要注意的是直至真菌培養(yǎng)、涂片全轉陰時,多數患者的LA結果往往仍呈陽性,考慮可能與死亡的隱球菌仍持續(xù)釋放莢膜多糖抗原,而機體清除此類抗原相對緩慢有關[49]，提示在疾病后期抗原滴度的變化對治療的指導作用有限。同時有研究報道，莢膜多糖抗原陽性在有隱球菌感染史AIDS患者的臨床意義難以確定，因為這種抗原血癥可持續(xù)存在數年之久，且抗原滴度的變化與有無復發(fā)之間無相關性[46,50]。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結節(jié)病、類風濕因子、巨球蛋白及毛孢子菌屬均與隱球菌莢膜多糖抗原存在交叉抗原,可引起假陽性結果；操作過程中乳膠手套中的滑石粉也可引起假陽性結果[51～53]。此外有報道在結核性腦膜炎患者也可出現假陽性結果，考慮可能與其血清中存在與隱球菌有交叉抗原的成分有關[52]。假陰性結果考慮與循環(huán)中的抗原水平尚低有關，在肺隱球菌病單獨存在而未發(fā)生肺外播散時，血清隱球菌抗原檢測可為陰性。高濃度隱球菌抗原所致的鉤帶現象和體內未知非特異性蛋白，可對隱球菌抗原產生掩蓋效應,可引起假陰性結果[51～53]。此外還應關注莢膜缺失的隱球菌所致慢性腦膜炎，此時也可呈假陰性結果[54]。

4 其他抗原成分

甘露糖廣泛存在于真菌胞壁中,是真菌胞壁的重要組成成分,在真菌致病過程中甘露糖參與了免疫調節(jié)和防御，同時抗甘露糖抗體具有保護性作用。Kume等[55]采用Pastorex 法檢測深部念珠菌血癥,其敏感度和特異度分別為91.7%和28.6%，但該法不與克柔念珠菌的甘露糖發(fā)生反應,故不能應用于克柔念珠菌病的診斷。另外，由于甘露糖廣泛存在于各種真菌細胞中,導致該檢測方法特異度較低,限制了臨床應用。

烯醇化酶(2-磷酸-D-甘油鹽水解酶)廣泛存在于真菌細胞中,目前研究較多的是念珠菌屬的烯醇化酶，其大量釋放與深部念珠菌感染有關。Walsh等[56]通過檢測血標本白色念珠菌烯醇化酶抗原確定是否存在深部真菌感染，結果顯示敏感度為75.0%,特異度為95.9% 。但該酶抗原性強，在體內清除較快，故檢測其抗體顯然更為有效。

Cand-Tec抗原是指可采用念珠菌屬檢測系統(tǒng)(一種顆粒凝集試驗系統(tǒng)) 檢測的一類念珠菌蛋白抗原,但文獻報道的敏感度和特異度不盡相同，加之類風濕因子可導致假陽性結果，目前其臨床應用價值有限。

目前，侵襲性深部真菌感染的最終診斷仍需結合臨床及傳統(tǒng)的診斷方法。由于各種診斷方法均有其優(yōu)勢和局限性，將各種診斷方法結合可提高診斷的準確性，尋找更具代表性的檢測物質，廣泛利用新技術提高檢測速度、靈敏度和特異度，建立新的診斷方法，是IFI早期診斷研究的發(fā)展方向。因此，真菌抗原成分檢測對IFI的早期診斷具有重要價值，且可通過對抗原滴度變化的監(jiān)測來判斷疾病的嚴重程度、抗真菌治療的效果及預后。

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