陳要臻，安群星，陳曉鵬，穆士杰，張獻(xiàn)清，余瑞

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誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS）的應(yīng)用進(jìn)展

陳要臻，安群星，陳曉鵬，穆士杰，張獻(xiàn)清，余瑞

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院輸血科

誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）自問世以來，取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。2006 年 8 月，Takahashi 和 Yamanaka[1]確定誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞生成的 4 種轉(zhuǎn)錄因子是：Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4。2007 年 11 ~12 月，日本的 Yamanaka 小組用這 4 種轉(zhuǎn)錄因子組合將人的體細(xì)胞重編程為 iPS 細(xì)胞[2]。美國的 Thomson 小組用 Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28 這 4 種轉(zhuǎn)錄因子也將人的體細(xì)胞重編程為 iPS 細(xì)胞[3]。由于iPS 細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）的生物學(xué)特性非常相似，又不涉及倫理道德問題，因此具有重要的臨床應(yīng)用潛能。iPS 細(xì)胞的未來是可以安全用于臨床的治療型干細(xì)胞，本文就iPS 細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性與應(yīng)用進(jìn)展做一綜述，并探討其應(yīng)用前景。

1 iPS 細(xì)胞的安全性

由于iPS 細(xì)胞有重要的臨床應(yīng)用潛能，因此將 iPS 細(xì)胞用于臨床治療前，要嚴(yán)格分析它的安全性。由于 c-Myc 是致癌基因，且 Klf4 也有一定的致癌能力[4-5]。為了提高iPS 細(xì)胞的安全性，科學(xué)家們做了很多研究，總結(jié)起來，主要有以下幾點：

⑴避免使用致癌基因。Wernig 等[6]和 Nakagawa 等[7]不用 c-Myc 因子，只用 Oct4、Sox2 和 Klf4 這 3 個轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞，并獲得了成功。Feng 等[8]用 Essrb 替代 c-Myc 和 Klf4 這兩個因子，與 Oct4 和 Sox2 共同作用把胎鼠成纖維細(xì)胞重編程為 iPS 細(xì)胞。組蛋白去乙?；敢种苿?VPA 與 Oct4 和 Sox2 兩個因子也可把人的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成 iPS 細(xì)胞[9]。Thomson 小組[3]用Oct-4、Sox2、Nanog 和 Lin28 誘導(dǎo)人的成纖維細(xì)胞為 iPS 細(xì)胞也可以避開c-Myc 和 Klf4 的致癌性。

⑵利用某些體細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)源因子，減少轉(zhuǎn)錄因子的使用數(shù)目。比如神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）和神經(jīng)前體細(xì)胞（neural progenitor cells，NPCs）可表達(dá) Sox2 因子，只用 Oct4 和 Klf4 兩個因子就可以誘導(dǎo) NSCs 和 NPCs 形成 iPS 細(xì)胞[10-11]。Kim 等[12]還發(fā)現(xiàn) NSCs 表達(dá) Sox2 和 Klf4 兩種因子只用 Oct4 一個因子就可以將成年小鼠的 NSCs 重編程為 iPS 細(xì)胞。

⑶將已整合的外源基因從 iPS 細(xì)胞的基因組中清除。使用基因編碼技術(shù)使得外來基因兩端存在特有標(biāo)志，誘導(dǎo)成功后，“Cre”酶識別這種標(biāo)志去除 iPS 細(xì)胞中的外源重編程因子以得到?jīng)]有外源因子的 iPS 細(xì)胞[13-14]。但是，Cre 介導(dǎo)的外源因子切除后，載體的一段 DNA 還留在插入位點上。而piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可將外源 DNA 徹底清除，不會引起基因組 DNA 序列的任何變化[15]。用 PB 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)表達(dá) 4 個 Yamanaka 因子誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞，然后在這些 iPS 細(xì)胞中瞬時表達(dá)轉(zhuǎn)座酶以切除外源 Yamanaka 因子。與“Cre”比較而言，PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是一種更安全的方法。

⑷小分子化合物替代轉(zhuǎn)錄因子。不僅外源基因有致癌的安全隱患，用于介導(dǎo)外源基因表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒也有潛在的安全問題。不管是逆轉(zhuǎn)錄病毒，還是慢病毒，都會把外源基因整合到基因組 DNA 中，這就有可能引起插入突變。為了減少或避免插入突變，有的實驗室進(jìn)行了小分子化合物的篩選，希望找到可替代這 4 個重編程因子的小分子化合物。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a 的抑制劑 BIX-01294 最早被發(fā)現(xiàn)可替代 Oct4，與其余的 3 個 Yamanaka 因子一起誘導(dǎo) NPCs 形成 iPS 細(xì)胞[16]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑 VPA 與前面已經(jīng)提到 Essrb 均可替代 c-Myc 和 Klf4 這兩個因子。

⑸利用腺病毒介導(dǎo)。為了完全避免整合性病毒或轉(zhuǎn)座子的使用，只在體細(xì)胞中瞬時表達(dá) Yamanaka 因子以誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞的形成。Stadtfeld 等[17]嘗試用腺病毒（不整合入基因組 DNA）來介導(dǎo) Yamanaka 因子的表達(dá)來誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞。盡管他們成功獲得了 iPS 細(xì)胞，并且沒有外源基因的插入，但誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞的效率很低。

⑹利用脂質(zhì)體介導(dǎo)。Okita 等[18]采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法來誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞。但是由于 iPS 細(xì)胞的形成大約需 10 -12 d 持續(xù)表達(dá) Yamanaka 因子[19]，因此這種方法要求反復(fù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以保證 Yamanaka 因子在重編程的前期持續(xù)表達(dá)，同腺病毒介導(dǎo)的方法一樣，誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞的效率很低。Yu 等[20]將Yamanaka 基因添加到質(zhì)粒的 DNA 環(huán)中（質(zhì)粒通常存在于細(xì)胞的染色體之外），然后用核轉(zhuǎn)染的方法將這些質(zhì)粒介入到人包皮細(xì)胞中。在質(zhì)粒中的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)會將細(xì)胞重新編程并使其成為 iPS 細(xì)胞。這些 iPS 細(xì)胞在接著的幾輪細(xì)胞分裂中會開始失去這些質(zhì)粒，這樣就可以分離出不含質(zhì)粒的 iPS 細(xì)胞。

⑺直接導(dǎo)入重編程因子的蛋白，來誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞的形成。在重編程因子蛋白上連接細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptide），這樣的融合蛋白可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，執(zhí)行其重編程的功能。蛋白誘導(dǎo)的小鼠和人 iPS 細(xì)胞都已實驗成功[21-22]，但是誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞的效率很低，而且蛋白容易失活。因為蛋白直接誘導(dǎo) iPS 細(xì)胞在重編程過程中不會涉及任何的遺傳修飾，所以，從 iPS 細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全角度來看，它是目前最安全的方法，但是需要進(jìn)一步提高其誘導(dǎo)效率。

⑻尋找安全性較高的 iPS 供體細(xì)胞。研究表明 iPS 細(xì)胞的供體細(xì)胞對于腫瘤形成有不同敏感性。Aoi 等[23]比較不同來源的 iPS 小鼠后代的成瘤趨勢和死亡率，發(fā)現(xiàn)由 MEF 細(xì)胞衍生得到的 iPS 小鼠的成瘤趨勢比從肝臟細(xì)胞和胃表皮細(xì)胞誘導(dǎo)得到的 iPS 細(xì)胞形成的小鼠要高很多，且前者的死亡率更高，存活時間短。Miura 等[24]利用小鼠胚胎的皮膚細(xì)胞、成年小鼠的胃細(xì)胞、尾巴的皮膚細(xì)胞以及肝臟細(xì)胞培育出的 36 種 iPS 細(xì)胞移植后使實驗鼠出現(xiàn)腫瘤的危險性存在很大差異。結(jié)果顯示，被植入分化細(xì)胞來自成年小鼠尾巴皮膚細(xì)胞的實驗鼠中有 83%體內(nèi)出現(xiàn)了腫瘤；被植入分化細(xì)胞來自于小鼠胚胎皮膚細(xì)胞的實驗鼠中只有 8%出現(xiàn)腫瘤；而如果實驗鼠移植的分化細(xì)胞來自成年小鼠的胃細(xì)胞，其體內(nèi)沒有出現(xiàn)腫瘤。上述研究表明選擇何種體細(xì)胞作為培育 iPS 細(xì)胞的原料是非常重要的。

總之，iPS 細(xì)胞應(yīng)用于臨床之前，其安全性需要進(jìn)一步的評價和提高，雖然很多研究都在這方面努力，但是徹底解決 iPS 細(xì)胞的安全性問題尚需時日。

2 iPS 細(xì)胞的應(yīng)用性

成功建立 iPS 細(xì)胞后，應(yīng)用 iPS 細(xì)胞來治療疾病是人們的最終目標(biāo)。iPS細(xì)胞不僅可用于分化和移植，還可以提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發(fā)新的治療方法。

⑴iPS 細(xì)胞的分化和移植在治療血液疾病中顯示了很大的用途。Xu 等[25]將 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮前體細(xì)胞，然后移植到患有血友病小鼠的肝臟中，使病鼠出血不止的癥狀得到了有效地改善。Hanna 等[26]將患病小鼠尾尖成纖維細(xì)胞重編程為 iPS 細(xì)胞，然后通過同源重組的方法用人野生型 βA-珠蛋白基因替代了 βS-珠蛋白基因，接著把遺傳修飾后的 iPS 細(xì)胞定向分化為造血祖細(xì)胞（HPs），并將純化后的 HPs 移植入 hβS/hβS 雄性小鼠中，HPs 有效地抑制了鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥癥狀。Raya 等[27]獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性iPS 細(xì)胞，這些 iPS 細(xì)胞能夠分化形成表型正常的髓系和紅系的造血祖細(xì)胞。中內(nèi)啟光等研究人員在培養(yǎng) iPS 細(xì)胞時，添加人類骨髓細(xì)胞以及促進(jìn)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)等物質(zhì)，結(jié)果 iPS 細(xì)胞分化成了血小板的前身巨核細(xì)胞，巨核細(xì)胞進(jìn)一步分化成血小板。從技術(shù)上來說，用 iPS 細(xì)胞培育人類紅細(xì)胞和白細(xì)胞都是可能的[28]。紅細(xì)胞體外培育的成功為人類研究通用紅細(xì)胞提供了新的契機。筆者所在研究組正在努力用一 O 型 Rh 陰性個體體細(xì)胞重編程為 iPS 細(xì)胞，進(jìn)而對該 iPS 細(xì)胞進(jìn)行體外定向誘導(dǎo)分化，培育出通用紅細(xì)胞。Lu 等[29]已建立了一個從人 ES 細(xì)胞高效地分化成紅細(xì)胞的系統(tǒng)。如果將該系統(tǒng)應(yīng)用于患者特異性 iPS 細(xì)胞上，就可獲得無限量的患者自身的紅細(xì)胞，這對于治療一些血液疾病以及為罕見血型患者提供血細(xì)胞有著重要意義。

⑵iPS 細(xì)胞還可治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Wernig 等[30]將 iPS 細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，然后把這些細(xì)胞移植入胎鼠腦中，它們可整合到受體鼠的腦中，13.5 d 后形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，包括谷氨酰胺能神經(jīng)元、GABA 能神經(jīng)元、兒茶酚胺能神經(jīng)元細(xì)胞。將由小鼠 iPS 細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化來的多巴胺能神經(jīng)元移植進(jìn)帕金森病大鼠模型腦內(nèi)，一段時間后可有效緩解大鼠疾病癥狀和改善其行為。最近，利用帕金森癥患者的皮膚細(xì)胞培育出iPS 細(xì)胞后，又成功將其分化為多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞，這是帕金森癥患者大腦中所缺少的一種重要細(xì)胞[31]。因此，其有望成為治療帕金森癥的一種方法。

⑶iPS 細(xì)胞也有望應(yīng)用于治療不孕癥。Park 等[32]將人 iPS 細(xì)胞體外分化并分離得到原始生殖細(xì)胞（PGCs）。PGCs 在基因表達(dá)上與體內(nèi)分離的 PGCs 極為相似。如果能夠進(jìn)一步將這些 PGCs 分化為精子和卵子，就可幫助患者解決不孕問題。

⑷來源于耳蝸毛細(xì)胞的iPS 細(xì)胞成功用于治療神經(jīng)感覺性聽力障礙[33]。iPS 細(xì)胞在體外還成功定向分化了多種細(xì)胞，例如胰腺細(xì)胞和肝細(xì)胞[34]、分泌胰島素的 β 細(xì)胞[35]、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞[36]。

⑸提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發(fā)新的治療方法。Dimos 等[37]和Ebert等[38]分別建立了肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）和脊髓性肌萎縮（SMA）患者特異性 iPS 細(xì)胞。通過定向誘導(dǎo)分化，將患者特異性的 iPS 細(xì)胞成功分化成了運動神經(jīng)元。這些由患者來源的 iPS 細(xì)胞分化等的運動神經(jīng)元為人們提供了一個體外研究 ALS 和 SMA 疾病的系統(tǒng)。在研究清楚了 ALS 和 SMA患者運動神經(jīng)元的致病機制后，還可在患者特異的 iPS 細(xì)胞中通過遺傳修飾來糾正基因缺陷，再分化得到功能正常的運動神經(jīng)元，以進(jìn)行移植治療。此外，Park 等[39]和 Soldner等[14]建立了多種遺傳病患者特異性的 iPS 細(xì)胞系，包括帕金森病、亨廷頓病、唐氏綜合征/三染色體 21 等。Loh 等[40]成功地以人血液細(xì)胞為體細(xì)胞供體，誘導(dǎo)出了 iPS 細(xì)胞，使得構(gòu)建一些病癥突變只局限于血液細(xì)胞的患者特異性 iPS 細(xì)胞成為可能。利用從罕見神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者身上產(chǎn)生的干細(xì)胞，科學(xué)家們正在解析該種疾病的發(fā)病機制，并以此來測試若干候選藥物的療效[41]。從家族性植物神經(jīng)功能不全癥（FD，有一個基因突變，該基因?qū)?IKAP 的蛋白進(jìn)行編碼，基因突變導(dǎo)致基因被轉(zhuǎn)譯成蛋白時部分基因序列被跳過）患者身上獲取皮膚細(xì)胞，創(chuàng)建出 iPS 細(xì)胞系，誘導(dǎo)為特定的細(xì)胞類型，如神經(jīng)嵴細(xì)胞（它能產(chǎn)生受 FD 影響的神經(jīng)元）。這些細(xì)胞在分化成神經(jīng)元的能力上是具有缺陷的，其并不像培養(yǎng)皿中的正常細(xì)胞一樣容易遷移。研究人員利用此種差異來衡量 3 種藥物的療效，這幾種藥已被提議作為治療 FD 的候選藥物，其中一種藥物就是激動素[41]。

這些患者特異性 iPS 細(xì)胞令體外研究病變的人體組織的形成成為可能，從而有助于探索疾病形成機制以及研發(fā)特異性新藥。這些研究成果還表明將來有可能為患者量身定做各種細(xì)胞，進(jìn)行個性化治療。但是由于對干細(xì)胞（包括 iPS 細(xì)胞、ES 細(xì)胞和成體干細(xì)胞）自我更新與分化等行為的調(diào)控機制知之甚少，目前人們還不能按照自己的意圖將干細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)分化為所需要的任何的功能細(xì)胞。隨著人類對干細(xì)胞分化調(diào)控機制認(rèn)識的不斷加深，從人 iPS 細(xì)胞將會衍生出更多種類的人類細(xì)胞，將為細(xì)胞替代治療新藥篩選與評價及其他用途提供大量的細(xì)胞。

3 小結(jié)與展望

由于 iPS 細(xì)胞自身的安全性問題，目前 iPS細(xì)胞還無法應(yīng)用于臨床治療。要得到安全實用的有臨床應(yīng)用價值的治療型 iPS 細(xì)胞，我們必須避免使用整合性病毒以及有致癌性的外源基因。根據(jù) iPS 細(xì)胞在短時間內(nèi)取得的一系列突破，可以預(yù)見，iPS 細(xì)胞必將解決人類面臨的各種疾患。目前，還面臨許多急待突破的瓶頸和需要深入研究的領(lǐng)域：①研究 iPS 細(xì)胞自我復(fù)制、增殖和分化等的調(diào)控機制及 iPS 細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化機制；②充分評價 iPS 細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性；③建立無遺傳修飾的 iPS 細(xì)胞制備方法（如僅利用蛋白或小分子化合物即將人的細(xì)胞重編程為 iPS 細(xì)胞）。

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安群星，Email：bestar@fmmu.edu.cn

2009-12-29

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.013