沈 陽(yáng),丁佑銘,呂仁更,朱以祥

(1.湖北省新華醫(yī)院普外科,武漢 430015;2.湖北省人民醫(yī)院肝膽外科 430000)

膽囊結(jié)石形成時(shí)Calponin、VIP在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達(dá)及意義

沈 陽(yáng)1,丁佑銘2,呂仁更1,朱以祥1

(1.湖北省新華醫(yī)院普外科,武漢 430015;2.湖北省人民醫(yī)院肝膽外科 430000)

目的探索血管活性腸肽(VIP)和調(diào)寧蛋白(Calponin)在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達(dá),并評(píng)估二者在膽囊膽固醇結(jié)石形成機(jī)制中的作用。方法(1)動(dòng)物模型:新西蘭兔40只,隨機(jī)分成對(duì)照組20只,喂普通飲食;結(jié)石組20只,飼喂含1.2 g/d膽固醇的成石飲食4周。免疫組化法測(cè)定Calponin、VIP在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達(dá)。結(jié)果結(jié)石組16只出現(xiàn)膽囊結(jié)石,19只出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶,對(duì)照組無(wú)結(jié)石及結(jié)晶出現(xiàn);結(jié)石組膽囊平滑肌Calponin和VIP陽(yáng)性產(chǎn)物與對(duì)照組相比較明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),Oddi括約肌Calponin和VIP陽(yáng)性產(chǎn)物與對(duì)照組相比較明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Calponin陽(yáng)性表達(dá)與VIP呈正相關(guān)。結(jié)論膽囊排空功能在膽囊結(jié)石形成中起重要作用,膽囊結(jié)石家兔膽囊排空障礙與Calponin、VIP明顯相關(guān)。

膽囊結(jié)石;調(diào)寧蛋白;血管活性腸肽;膽囊平滑肌;Oddi括約肌

目前認(rèn)為膽囊膽固醇結(jié)石形成機(jī)制是膽汁膽固醇過(guò)飽和、膽汁中成核因子的活性異常和膽道動(dòng)力學(xué)改變?nèi)咦饔玫慕Y(jié)果。膽道動(dòng)力學(xué)改變是膽石形成不可缺少的條件。本研究采用免疫組化方法,測(cè)定調(diào)寧蛋白(Calponin)以及血管活性腸肽(VIP)在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達(dá),分析二者在膽道動(dòng)力中所起的作用和相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性新西蘭兔40只(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體質(zhì)量1.80～2.50 kg,隨機(jī)分為兩組,即對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組。每組20只,對(duì)照組喂普通顆粒飼料(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),實(shí)驗(yàn)組飼喂1.2%高膽固醇飼料(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。置于隔離動(dòng)物房喂養(yǎng),自由進(jìn)水。兩組飼喂普通顆粒飼料1周,每只分別100 g/d,然后對(duì)照組續(xù)進(jìn)普通顆粒飼料(每只 100 g/d),而實(shí)驗(yàn)組則飼喂1.2%高膽固醇飼料(每只100 g/d,其中膽固醇為每只1.2 g/d)。飼養(yǎng)時(shí)間為4周。

1.2 標(biāo)本收集 飼養(yǎng)時(shí)間充足后,剖殺前12 h禁食,4 h禁水。耳緣靜脈20%烏拉坦麻醉。常規(guī)消毒,剖腹取膽囊平滑肌以及Oddi括約肌。4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片4 μ m。收集膽汁并觀察成石情況。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 膽囊膽汁膽固醇結(jié)晶及結(jié)石鑒定 結(jié)石判斷標(biāo)準(zhǔn):肉眼觀察膽汁內(nèi)有成形粗大顆粒,光鏡下觀察為致密大團(tuán)塊結(jié)晶膽固醇即定為結(jié)石[1],正常兔膽囊膽汁均未見(jiàn)有形成分。膽固醇結(jié)晶定量:取部分膽囊膽汁離心,沉淀物涂片,光鏡下觀察有無(wú)膽固醇結(jié)晶。膽固醇結(jié)晶定量參照文獻(xiàn)[2]標(biāo)準(zhǔn)分為+,++,+++及++++4個(gè)等級(jí)。

1.3.2 VIP、Calponin在膽囊平滑肌以及 Oddi括約肌的表達(dá)

S-P法染色測(cè)定Calponin和VIP在膽囊平滑肌和Oddi擴(kuò)約肌的表達(dá)(以Calponin為例,免疫組化相關(guān)試劑購(gòu)自Sigma公司),石蠟切片脫蠟、水化;磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)洗2～3次,每次5 min;滴加3%H2O2(80%甲醇),室溫靜置10 min;PB緩沖液洗2～3次,每次5 min;抗原修復(fù)(檸檬酸高溫修復(fù));PBS洗2～3次,每次5 min;滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。甩去多余液體。滴加CalponinⅠ抗 50 μ L,室溫靜置1 h或者 4℃過(guò)夜或者37℃1 h。PBS洗3次,每次 5 min;滴加生物素Ⅱ抗40～50 μ L,室溫靜置1 h或37℃1 h;Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20。PBS洗3次,每次5 min;DAB顯色5～10 min,在顯微鏡下掌握染色程度;PBS或自來(lái)水沖洗10 min;蘇木精復(fù)染2 min,鹽酸酒精分化;自來(lái)水沖洗10～15 min;脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3.3 VIP、Calponin免疫組化染色結(jié)果的判斷(陽(yáng)性表達(dá)位置均在胞漿,為棕黃色顆粒) 在高倍視野下(×400)隨機(jī)取5個(gè)視野(每個(gè)視野不少于50個(gè)細(xì)胞),按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行半定量分析(CIAS-1000細(xì)胞圖像分析儀半定量分析)。-:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞;+:低度表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞小于10%);++:中度表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞10%～50%);+++:高度表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞大于50%)。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞與低度表達(dá)視為陰性,中度表達(dá)與高度表達(dá)視為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用χ2檢驗(yàn)及直線相關(guān)分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況及體質(zhì)量變化 對(duì)照組動(dòng)物生長(zhǎng)良好,平均每周體質(zhì)量增加0.05～0.10 kg,試驗(yàn)組飼高膽固醇膳食生長(zhǎng)較快,體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯,每周平均增長(zhǎng)0.15～0.20 kg,各組動(dòng)物喂養(yǎng)期間均無(wú)死亡。

2.2 膽汁膽固醇結(jié)晶與成石情況 對(duì)照組膽囊膽汁幾乎無(wú)膽固醇結(jié)晶,實(shí)驗(yàn)組16只可見(jiàn)明顯結(jié)石顆粒,19只可見(jiàn)膽固醇結(jié)晶。

2.3 膽囊平滑肌中Calponin和VIP的陽(yáng)性產(chǎn)物的變化 結(jié)石組Calponin和VIP的陽(yáng)性產(chǎn)物在顯微鏡下與對(duì)照組比較顯著增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見(jiàn)表1。

表1 兩組膽囊平滑肌中Calponin和VIP的表達(dá)結(jié)果

2.4 Oddi括約肌中Calponin和VIP的陽(yáng)性產(chǎn)物的變化 結(jié)石組Calponin和VIP的陽(yáng)性產(chǎn)物在顯微鏡下與對(duì)照組比較顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見(jiàn)表2。

表2 兩組Oddi括約肌中Calponin和VIP的表達(dá)結(jié)果

2.5 膽囊平滑肌及Oddi括約肌中Calponin和VIP的相關(guān)性

膽囊平滑肌中Calponin表達(dá)的陽(yáng)性率與VIP表達(dá)的陽(yáng)性率呈正相關(guān)Y(Calponin)=22.813+0.646X(VIP),r=0.785,P＜0.05。Oddi括約肌中Calponin表達(dá)的陽(yáng)性率與VIP表達(dá)的陽(yáng)性率呈正相關(guān)Y(Calponin)=9.652+0.473X(VIP),r=0.624,P＜0.05。

3 討 論

膽囊膽固醇結(jié)石的形成不是單一病理因素所致,而是膽道系統(tǒng)在多種因素的影響下發(fā)生的一系列病理變化的結(jié)果。膽囊膽固醇的成因目前尚存在一定的爭(zhēng)議。近年來(lái),對(duì)膽汁成分的改變,膽固醇磷脂泡、促成核因子和抗成核因子的失衡病理因素作了較多研究,而對(duì)膽囊運(yùn)動(dòng)在膽石形成中的作用研究相對(duì)較少。

膽囊是貯存和濃縮膽汁的器官,具有節(jié)律性和緊張性收縮運(yùn)動(dòng)的功能,膽囊收縮力下降是引起膽囊排空障礙的主要?jiǎng)恿W(xué)因素,促進(jìn)膽囊收縮力能有效增加膽囊排空[3]。膽囊是一個(gè)彈性的囊體,和膽道系統(tǒng)相連。在非消化期間,肝細(xì)胞不斷分泌膽汁流入膽囊內(nèi)貯存。膽囊可吸收膽汁中的水分和無(wú)機(jī)鹽,使肝膽汁濃縮4～10倍,增加了貯存的效能?？崭箷r(shí),膽囊多呈松弛狀態(tài),進(jìn)食后則呈張力性收縮。正常情況下,膽囊和Oddi括約肌的活動(dòng)表現(xiàn)出協(xié)調(diào)的相互關(guān)系:Oddi括約肌收縮時(shí)膽囊舒張,從而使肝膽汁貯入膽囊;反之,膽囊收縮,Oddi括約肌舒張,肝膽汁和膽囊膽汁便流入十二指腸。所以膽囊平滑肌和Oddi括約肌的功能紊亂會(huì)導(dǎo)致膽汁排放受阻,從而促進(jìn)膽囊膽固醇結(jié)石的形成。

平滑肌細(xì)胞有粗細(xì)肌絲組成,粗肌絲主要由肌球蛋白組成。而細(xì)肌絲主要由肌動(dòng)蛋白組成,但不含有骨骼肌所有的肌鈣蛋白。平滑肌沒(méi)有骨骼肌那樣發(fā)達(dá)的肌管系統(tǒng),而是肌膜。平滑肌細(xì)胞受刺激時(shí),細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi),但細(xì)胞中靠近肌膜的肌漿網(wǎng)也構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)Ca2+貯存庫(kù)。一些興奮性遞質(zhì)、激素或者藥物同肌膜受體結(jié)合,通過(guò)G蛋白在胞漿內(nèi)產(chǎn)生第二信使,引起Ca2+庫(kù)中的Ca2+釋出。Ca2+先結(jié)合于胞漿中鈣調(diào)蛋白,后者結(jié)合了4個(gè)Ca2+后使肌球蛋白激酶活化,使A TP分解,從而使橫橋磷酸化,既而激活橫橋,導(dǎo)致平滑肌收縮。

VIP在膽囊的功能調(diào)節(jié)上起重要作用,Strah等[4]利用狗膽瘺模型進(jìn)行體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),膽囊受著3種迷走神經(jīng)纖維共同支配,即膽堿能、膽囊收縮素(CCK)和VIP能。膽堿能和CCK能神經(jīng)可使膽囊張力增強(qiáng),收縮性加強(qiáng),而VIP能神經(jīng)則抑制膽囊收縮。生理情況下,膽囊的張力和排空是受興奮性的膽堿能、CCK能和具抑制性的VIP能神經(jīng)共同調(diào)節(jié)的。用免疫組化和放射免疫測(cè)定技術(shù)對(duì)膽囊組織VIP產(chǎn)生及分泌進(jìn)行定位和定量研究,發(fā)現(xiàn)膽囊上皮細(xì)胞膜上有結(jié)合VIP的特異性受體,而膽囊組織內(nèi)沒(méi)有產(chǎn)生VIP的內(nèi)分泌細(xì)胞;膽囊產(chǎn)生的VIP主要是由膽囊壁內(nèi)的VIP能神經(jīng)纖維所釋放。膽囊排空受復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控,新近證實(shí)主要促排空激素是CCK,主要抑制排空激素是VIP[5]。VIP能降低膽囊的張力和抑制膽囊收縮,在離體情況下呈劑量相關(guān)性抑制CCK的收縮膽囊作用對(duì)VIP引起平滑肌松弛的機(jī)制,目前認(rèn)為與迷走神經(jīng)受到刺激后,膽囊壁的VIP能神經(jīng)纖維釋放VIP增加有關(guān),它與上皮細(xì)胞膜上高親和力受體結(jié)合,激活了腺苷酸環(huán)化酶,使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度增加,增加Ca2+從細(xì)胞內(nèi)排出和抑制Ca2+從鈣池釋放,同時(shí)抑制肌球蛋白的磷酸化,使平滑肌處于松弛狀態(tài)。

CaP是一種平滑肌特有的收縮調(diào)控蛋白[6-8],幾乎存在于所有哺乳動(dòng)物和人的各種平滑肌組織中。調(diào)寧蛋白根據(jù)其等電點(diǎn)不同可分為3種異構(gòu)體,堿性調(diào)寧蛋白h1,中性調(diào)寧蛋白h2和酸性調(diào)寧蛋白,平滑肌組織中主要為h1型[8-10],其氨基酸及核苷酸序列已完整測(cè)出[8,10]。Strasser等[10]對(duì)調(diào)寧蛋白的功能進(jìn)行了詳細(xì)研究,發(fā)現(xiàn)調(diào)寧蛋白能與其他蛋白結(jié)合,但與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合直接影響調(diào)寧蛋白的功能。調(diào)寧蛋白能抑制肌動(dòng)球蛋白三磷酸腺苷(ATP)酶的活性,具有對(duì)肌動(dòng)蛋白單體的聚合作用,肌動(dòng)蛋白肌絲的集束作用,可與肌動(dòng)蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)及原肌球蛋白(tropomyosin)結(jié)合,并能與鈣結(jié)合蛋白如鈣調(diào)素、鈣調(diào)蛋白及S100蛋白結(jié)合,調(diào)寧蛋白能被蛋白激酶C及鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ磷酸化,被磷酸酶脫磷酸化。當(dāng)調(diào)寧蛋白磷酸化時(shí),與肌動(dòng)蛋白絲分離,失去對(duì)肌動(dòng)球蛋白ATP酶的抑制作用,使肌肉收縮;調(diào)寧蛋白脫磷酸化時(shí)表現(xiàn)出抑制肌動(dòng)球蛋白ATP酶活性,使肌肉舒張。調(diào)寧蛋白還能抑制肌動(dòng)蛋白絲相對(duì)于肌球蛋白絲的滑行。

在此次實(shí)驗(yàn)中,結(jié)石組16只(16/20)出現(xiàn)膽囊結(jié)石,19只(19/20)出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶,對(duì)照組無(wú)結(jié)石及結(jié)晶出現(xiàn);結(jié)石組膽囊平滑肌Calponin和VIP陽(yáng)性產(chǎn)物與對(duì)照組相比較明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),從而抑制膽囊平滑肌收縮。Oddi括約肌Calponin和VIP陽(yáng)性物與對(duì)照組相比較明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。從而使兩者抑制Oddi括約肌收縮的功能減弱,導(dǎo)致Oddi括約肌痙攣。所以可以導(dǎo)致膽汁排放受阻,促進(jìn)膽囊膽固醇結(jié)石的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為,膽囊排空功能在膽囊結(jié)石形成中起重要作用,而膽囊結(jié)石家兔膽囊排空障礙與Calponin、VIP明顯相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究,從膽囊平滑肌及Oddi括約肌協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)入路,旨在進(jìn)一步明了膽囊結(jié)石形成病因,實(shí)驗(yàn)證實(shí)Calponin陽(yáng)性表達(dá)與調(diào)寧蛋白呈正相關(guān),表明二者協(xié)同參與平滑肌的收縮,但具體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Changes of vasoactive intestinal polypeptide and Calponin expression in gallbladder smooth muscle and Oddi sphincter in rabbits with cholesterol gallstone

SHEN Yang1,DINGYou-ming2,LV Ren-geng1,et al.
(1.Department of General Surgery,Hubei Xinhua Hospital,Wuhan430015,China;2.Departmentof Hepatobiliary Surgery,Hubei Provincial People's Hospital,Wuhan,Hubei430000,China)

ObjectiveTo study the role of vasoactive intestinal polypeptide(VIP)and Calponin in the pathogenesis of cholecystolithiasis.MethodsTwo dietary groups of New Zealand rabbits with 20 in each were allocated 1.2 g/d high cholesterol diet and common diet for 4 weeks.ResultsComparing with the negative result in control group,cholesterol crystals and stones were found in 19 and 16 out of 20 gallbladders,respectively,under the polarizing microscope in lithogenic group.The positive expression of VIP and Calponin in gallbladder smooth muscle in lithogenic group was much higer than those in control group(P＜0.05).The positive expression of VIP and Calponin in Oddi sphincter in lithogenic group was much lower than those in control group(P＜0.05).The positive expression of VIP had a significant relation with Calponin(P＜0.05).ConclusionThe disorder of Calponin and VIP regulation,which induces gallbladder function disorder,plays an important role in gallstone formation.

gallstone;Calponin;vasoactive intestinal polypeptide;smooth muscle of gallbladder;Oddi sphincter

R657.42;R-332

A

1671-8348(2010)05-0524-03

2009-08-15

2009-09-10)

?論 著?