王亞利，范春雷，竇曉兵

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053)

血管疾病的主要危險因子之一。低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDL-R)介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞作用在低密度脂蛋白(LDL)的代謝過程中起著重要作用?，F(xiàn)代研究表明，許多藥物具有降血脂作用，如絞股藍總皂苷［1］、姜黃素［2］、黃連素［3］、多廿醇［4］等。本文研究旨在用不同濃度的絞股藍總皂苷干預(yù)培養(yǎng)HepG2細胞系來分析細胞LDL受體的功能活性。

1 材料與方法

1.1 材料 肝細胞HepG2，購自中科院細胞庫;絞股藍總皂苷，安徽甙爾塔天然有機化合物信息中心提供;DiI-LDL，本實驗室制備［5］。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測絞股藍總皂苷對HepG2細胞增殖活力的影響 用體積分數(shù)0.1 FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的HepG2細胞以1.0 ×104/孔接種于 96 孔板，每孔 100 μl，加入不同劑量的絞股藍總皂苷，終濃度分別為 1、2、5、10、20、30、40、50、70 μmol·L－1?？瞻讓φ战M不加藥。每組 6 復(fù)孔，培養(yǎng)48 h;加入 MTT 孵育，4 h 后加入 DMSO 150 μl，震蕩10 min，以無細胞空白孔為零點，在波長570 nm處檢測OD值。

1.2.2 絞股藍總皂苷對肝細胞HepG2LDLR基因表達的影響 實驗設(shè)3個給藥組，一個空白對照組，一個無脂血清(LPDS)陽性對照組，一個陰性抑制對照組。給藥組加入含絞股藍總皂苷的體積分數(shù)0.1 FBS的DMEM培養(yǎng)液，使其終濃度分別達到5、10、20 mg·L－1?？瞻讓φ战M不加絞股藍總皂苷培養(yǎng)液，陽性對照組分別用體積分數(shù)0.1的LPDS和20 μmol·L－1的姜黃素;而陰性對照組用 10 mg·L－1的 25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol，25-HC)。其它步驟與給藥組相同。操作如下:① 按上述分組培養(yǎng)肝癌細胞HepG2及分別加藥繼續(xù)培養(yǎng)48 h;②倒掉培養(yǎng)液，各加入D-Hanks洗液，輕輕搖晃培養(yǎng)板，洗滌細胞;③ 加DiI-LDL，終濃度至20 mg·L－1，37℃孵育 4 h，再置4℃，30 min;④ 充分洗滌殘余DiI;⑤熒光顯微鏡和流式細胞儀進行定性定量分析。

2 結(jié)果

2.1 絞股藍總皂苷對HepG2細胞增殖活力的影響 不同濃度的絞股藍總皂苷與HepG2細胞共培養(yǎng)2 d后，用MTT法測定。結(jié)果表明70 mg·L－1濃度內(nèi)的絞股藍總皂苷對HepG2細胞增殖活性無影響。

2.2 絞股藍總皂苷對肝細胞HepG2LDL-R基因表達的影響 熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明，5、10和20 mg·L－1不同濃度的絞股藍總皂苷以及陽性對照組LPDS和姜黃素均增加HepG2細胞LDL-R的表達。陰性抑制對照組25-HC則抑制HepG2細胞LDL-R的表達。

流式細胞儀定量分析結(jié)果表明，和對照組相比，5、10和20 mg·L－1不同濃度的絞股藍總皂苷對增加HepG2細胞LDL-R表達的作用明顯，各組的DiI熒光幾何平均數(shù)分別為26.6、32.6、45.6;空白對照組為21.9;陽性對照組體積分數(shù)0.1 LPDS 及 20 μmol·L－1姜黃素分別為 41.4、34.2;陰性對照組10 mg·L－125-HC為3.8。陽性對照組及絞股藍總皂苷均增加HepG2細胞LDL-R的表達;陰性對照組則抑制了HepG2細胞LDL-R的表達。

3 討論

肝臟是血漿LDL-C代謝的主要器官。因此，本文研究中，以肝細胞系HepG2為材料，研究了絞股藍總皂苷對LDLR表達的影響。中藥成分可能會影響培養(yǎng)細胞正常生長。MTT實驗表明70 mg·L－1以內(nèi)的絞股藍總皂苷對HepG2細胞增殖活性無明顯影響。

LDL作為LDL-R的配體，可與細胞LDL-R特異性結(jié)合，并可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞。本文用熒光試劑DiI標記LDL，可作為熒光探針檢測細胞LDL-R的活性。結(jié)果表明5、10和20 mg·L－1不同濃度的絞股藍總皂苷組及兩個陽性組LPDS和姜黃素均促進了LDL-R的表達。陰性抑制對照組25-HC中LDL-R的表達則被明顯抑制。說明實驗檢測的目標蛋白準確?？傊险{(diào)LDL-R的基因表達是絞股藍總皂苷降血脂和抗動脈粥樣硬化的作用機制之一。

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