曹碧茵，孫 雪，楊亞萍，，孔 巖，劉春風(fēng)，

(1.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇蘇州 215004;2.蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，江蘇蘇州 215123)

CAO Bi-yin1，SUN Xue1，YANG Ya-ping1，2，KONG Yan2，LIU Chun-feng1，2

(1.Dept of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215004，China;2.Institute of Neuroscience，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China)

酸敏感離子通道(acid sensing ion channels，ASICs)是一類能被細(xì)胞外H+激活的陽(yáng)離子通道，其中的ASIC1a亞基能介導(dǎo)鈣的內(nèi)流，參與了腦缺血缺氧、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程［1］。阻斷ASIC1a的激活或降低其表達(dá)均可起到一定的神經(jīng)保護(hù)作用［2］，為神經(jīng)退行性疾病提供了一個(gè)新的防治策略。本研究在PC12細(xì)胞上觀察酸性培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度、ASIC1a轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響，并給予芍藥苷(Paeoniflorin，PF)進(jìn)行干預(yù)，ASICs的非特異性阻斷劑阿米洛利(amiloride，Ami)作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，以探討PF對(duì)ASIC1a的表達(dá)是否具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;Amiloride、Fluo-3/Am購(gòu)自Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、新生牛血清購(gòu)自Gibco公司;定量RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;兔抗ASIC1抗體購(gòu)自Alpha Diagnostic International公司;小鼠抗β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠抗體、ECL發(fā)光劑等均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 PC12細(xì)胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前1 d接種于6孔培養(yǎng)板，穩(wěn)定生長(zhǎng)24 h，將細(xì)胞分為4組:正常對(duì)照組(control)更換為pH 7.2的新鮮培養(yǎng)基;酸處理組(pH 6.0)更換為pH 6.0的酸性培養(yǎng)基;Ami組和PF組則分別在酸性培養(yǎng)基內(nèi)加入 Ami(100 μmol·L－1)或 PF(50 μmol·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化 收集細(xì)胞，預(yù)冷無(wú)鈣磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L－1。取 200 μl細(xì)胞懸液，加入終濃度為 10 μmol·L－1的 Fluo-3/Am，37℃ 孵育 30 min，漂洗后重懸于 200 μl PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，每組取10 000個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值的平均值為每份標(biāo)本的測(cè)定值。

1.4 定量RT-PCR檢測(cè)ASIC1a mRNA轉(zhuǎn)錄水平 提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT反應(yīng)，得cDNA模板。根據(jù)目的基因在GenBank中的已知序列，由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)合成引物。ASIC1a引物:上游5′-GCCCACATCTTCTCCTAT-3′，下游 5′-CTTGGTGACGTGGTGATA-3′;β-actin 引物:上游 5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游 5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。兩步法進(jìn)行 PCR反應(yīng)，同時(shí)測(cè)定各樣本的溶解曲線。每樣本做3個(gè)復(fù)管，求出各樣本平均 Ct(cycle threshold)值，再按2－△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析，求出各組細(xì)胞ASIC1a mRNA相對(duì)于正常對(duì)照組的Fold值。將上述過(guò)程重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 Western blot檢測(cè)ASIC1a的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)濃度測(cè)定及變性后，取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別加入ASIC1(1∶1 000)和 β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h，ECL發(fā)光法顯影于X光膠片上。免疫印跡條帶密度=面積×灰度，每個(gè)樣本的條帶密度與同一樣本的β-actin進(jìn)行比較求出比值，再計(jì)算出相對(duì)于正常對(duì)照組的Fold值。將整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化 pH 6.0組Fluo-3的平均熒光強(qiáng)度為4.55±0.45，高于 control組(2.44±0.03，P=0.015);與pH 6.0組相比，Ami組和PF組的熒光強(qiáng)度降低(3.15±0.38)s(P=0.003)、(3.01±0.18)s(P=0.002)，但是control組、Ami組和PF組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組細(xì)胞ASIC1a mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化 pH 6.0組ASIC1a mRNA的轉(zhuǎn)錄水平升高至control組的(3.36±1.30)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)。與pH 6.0組相比，Ami組和 PF組 ASIC1a mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低(0.63±0.48)s(P=0.007)、(1.19±0.31)s(P=0.018)，但是control組、Ami組和PF組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組細(xì)胞ASIC1a蛋白表達(dá)的改變 pH 6.0組ASIC1a的蛋白表達(dá)水平升高到control組的(1.29±0.11)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。與pH 6.0組相比，Ami組和PF組ASIC1a的表達(dá)降低(0.58±0.16)s(P=0.004)、(0.70±0.23)s(P=0.010)，但是 control組、Ami組和 PF組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

ASIC1a亞基在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，可直接或間接促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，引起隨之發(fā)生的鈣超載和細(xì)胞凋亡［2］。ASICs與PD、HD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系日益得到關(guān)注，阻斷ASIC1a的通道功能或利用基因敲除技術(shù)減少ASIC1a的蛋白表達(dá)均能起到治療作用［3，4］。尋找以ASICs為靶點(diǎn)的藥物，設(shè)計(jì)和改造具有高選擇性和高活性的ASICs抑制劑成為神經(jīng)生物學(xué)和藥物化學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。

PF是芍藥的主要活性成分，抑制炎癥反應(yīng)［5，6］、減少鈣內(nèi)流、清除活性氧［7］、拮抗神經(jīng)細(xì)胞的受損死亡，在 PD［8］、腦缺血缺氧［9］、癲癇等多種病理模型中發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用，而這些病理模型均表現(xiàn)出局部的組織酸化現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)了ASICs的異常激活。因此，ASICs可能是PF發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的潛在靶點(diǎn)。

本研究利用pH 6.0的酸性培養(yǎng)基特異性地激活A(yù)SIC1a亞基，導(dǎo)致PC12細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子升高，ASIC1a的表達(dá)水平明顯上調(diào)。PF不但降低了細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，還使ASIC1a的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均維持在正常狀態(tài)，其藥效與Ami相比沒(méi)有明顯差異，并且有效濃度低于Ami，因此PF有可能是ASIC1a的天然抑制劑。

(致謝:蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院、江蘇省放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為本研究提供了良好的科研條件和大力支持。)

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