劉傳亮，王 輝，陳偉娟，王曉杰，李洪利，趙修世，李文通

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在乳腺癌的綜合治療中，化療占有十分重要的地位，然而臨床上許多腫瘤患者在經(jīng)歷了數(shù)次有效的化療后對化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)。在MDR的研究中發(fā)現(xiàn)，多藥耐藥的乳腺癌細胞株侵襲、轉(zhuǎn)移能力與親本細胞相比明顯增強，近來研究表明耐藥細胞在形態(tài)上發(fā)生了上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)樣改變［1］，說明MDR與EMT間存在聯(lián)系。在本實驗中，我們將Snail真核表達載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞后，再對細胞用阿霉素進行誘導(dǎo)，以觀察乳腺癌細胞EMT發(fā)生對P-糖蛋白(P-glucoprotein，P-gp)介導(dǎo)的MDR的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MMLV cDNA試劑盒、PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、SYBR Real-time PCR試劑盒及Pfu DNA聚合酶購自大連寶生物公司;T/A克隆試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;真核表達載體pCDNA3.1(－)及LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司;RNA提取試劑TRIzol購自北京索萊寶科技有限公司;P-gp抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;MTT購自Sigma;阿霉素(adriamycin，ADM)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FCS)購自 Gibco。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建pCDNA3.1-Snail真核表達載體 從乳腺癌組織(濰坊市人民醫(yī)院提供)中用TRIzol提取組織RNA，取2 μg逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以此為模板用Pfu擴增 Snail基因(NM_005985.2)，上游引物:5′-CCACTATGCCGCGCTCTTT-3′;下 游 引 物:5′-TCAG CGGGGACATCCTGAGCA-3′;PCR產(chǎn)物末端加 A后連接至T載體，構(gòu)建成載體pUCm-T-Snail。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α后，進行藍白斑篩選，Not I、BamH I做雙酶切鑒定，陽性克隆測序鑒定，測序正確后采用Not I、BamH I進行雙酶切;酶切產(chǎn)物連接到pCDNA3構(gòu)建成pCDNA-Snail真核表達載體，并酶切鑒定。

1.2.2 細胞系的建立 人乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染載體，按說明書進行操作，G418進行快速篩選。采用阿霉素低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法［2］誘導(dǎo)細胞，并分別命名為MCF-7/ADM100、MCF-7/snail-ADM100和 MCF-7/pCDNA-ADM100。

1.2.3 細胞毒性試驗 取生長期細胞，配成1×107·L－1細胞懸液，接種于96孔板。24 h后加入含有0.1、0.4、1.6、6.4、25.4 mg·L－1阿霉素的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48～72 h，棄上清，加 MTT。培養(yǎng)4 h，加入DMSO，測550 nm OD值。存活率按實驗組與對照組吸收值之比×100%計算，取3次實驗的均值作圖求 IC50值［3］。

1.2.4 阿霉素外排實驗 取生長期細胞，制備細胞懸液并轉(zhuǎn)移到24孔板上;阿霉素誘導(dǎo)組加入含20 μmol·L－1阿霉素的培養(yǎng)基，對照組加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min后，用預(yù)冷的完全培養(yǎng)基沖洗，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，用預(yù)冷的PBS沖洗，置于冰上;流式細胞儀(FACS Calibur)測定細胞488 nm的熒光強度。

1.2.5 細胞中P-gp的表達 收集生長期細胞，PBS洗兩遍，用4%多聚甲醛固定40 min，PBS洗3次;加P-gp一抗，37℃孵育40 min，PBS沖洗2次;加FITC標(biāo)記的IgG，4℃避光反應(yīng)30 min，PBS沖洗3次，加300 ml PBS，用流式細胞儀檢測。

1.2.6 Real-time PCR TRIzol法提取細胞中總RNA后，取2 μg使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)成 cDNA;Real-time PCR反應(yīng)使用SYBR Green I檢測，按說明書進行操作。PCR引物 (上海生工合成)序列如(Tab 1)所示。

Tab 1 The primer of Snail，MDR1 and β-actin

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用ˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 pCDNA3.1-Snail真核表達載體的鑒定 通過RT-PCR可獲得特異性Snail基因片段，長約799 bp(Fig 1A)。載體pUCm-T-Snail進行酶切鑒定，陽性克隆約在900 bp處見插入的Snail基因片段(Fig 1B)。陽性克隆測序后在Blast上進行比對(Fig 2)。

2.2 細胞毒性試驗 MTT檢測結(jié)果顯示MCF-7/Snail-ADM100細胞耐藥性高于MCF-7/ADM100細胞(P<0.05，Tab 2)。而且在同等藥物濃度下，MCF-7/Snail-ADM100組細胞生存率高于其它各組(Fig 3)。

2.3 阿霉素外排實驗 MCF-7、MCF-7/ADM100，MCF-7/pCDNA-ADM100和MCF-7/Snail-ADM100 4組細胞外排1 h后細胞內(nèi)的阿霉素的熒光強度分別為196.3±18.97、50.8±6.33、48.3±4.98和7.1±0.85。MCF-7/Snail-ADM100細胞中藥物濃度明顯降低(P<0.05，F(xiàn)ig 4)。

Fig 1 A:Electrophoresis of Snail PCR amplification products;B:Enzyme digestion map of pUCm-T-Snail vector

Fig 2 Results of pUCm-T-Snail sequencing(From 9 bp to 834 bp)

Tab 2IC50value of cells to doxorubicin(±s，n=3)

Tab 2IC50value of cells to doxorubicin(±s，n=3)

*P<0.05 vs IC50value of MCF-7;#P<0.05 vs IC50value of MCF-7/ADM100;▲P<0.05 vs IC50value of MCF-7/pCDNA-ADM100

IC50values/mg·L－1RR MCF-7 0.03±0.015 1 MCF-7/ADM100 0.96±0.132* 32.1 MCF-7/pCDNA-DM100 0.95±0.098* 31.7 MCF-7/Snail-ADM100 32.76 ±4.531*#▲109.2

2.4 細胞中P-gp的表達 流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示，MCF-7、MCF-7/ADM100、MCF-7/pCDNA-ADM 100和MCF-7/Snail-ADM100 4組細胞上P-gp熒光強度分別為 5.7±0.48、78.3±8.33、77.5±7.97、91.6±9.42。與MCF-7/ADM100細胞相比MCF-7/Snail-ADM100細胞上P-gp熒光強度明顯升高(P<0.05)。

Fig 3 Survival rate of cell lines

Fig 4 The result of ADM efflux assy

2.5 MDR1，Snail在細胞中的表達 分別將MCF-7細胞中 MDR1，Snail的均作為 1，在 MCF-7/ADM100細胞中兩種mRNA水平分別為20.42±2.45、34.48±4.31，MCF-7/pCDNA-ADM100 細胞兩種mRNA水平分別為21.02±3.09、33.79±4.11，而在MCF-7/Snail-ADM100細胞中兩種mRNA水平分別為130.2±15.76和112.2±13.27，較之其它細胞明顯升高(P<0.05，F(xiàn)ig 5)。

3 討論

MDR是指腫瘤細胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性后，對結(jié)構(gòu)和作用機制不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性，與腫瘤化療效果降低緊密相關(guān)［4］;EMT是指上皮細胞失去極性，獲得間質(zhì)細胞表型的現(xiàn)象。在EMT發(fā)生過程中，細胞骨架重塑，細胞遷移能力增強，可引起腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移［5］。在多數(shù)腫瘤的進展過程中，均可出現(xiàn)MDR與EMT現(xiàn)象。近年來研究發(fā)現(xiàn)高表達 P-gp的多藥耐藥腫瘤細胞表現(xiàn)出較強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［6］。采用阿霉素誘導(dǎo)MCF-7細胞在使細獲得MDR的同時，也使細胞發(fā)生EMT樣變化［1］，這說明腫瘤細胞MDR與EMT之間可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，但腫瘤細胞能否通過EMT產(chǎn)生MDR變化尚不清楚，國內(nèi)外亦未見該方面相關(guān)報道。為能證明EMT的發(fā)生能導(dǎo)致和促進P-gp介導(dǎo)的MDR，我們進行了初步研究。

Massoumi等［7］研究表明，通過轉(zhuǎn)染 Snail表達載體可使細胞獲得EMT樣組織學(xué)特征，而體外應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制Snail表達則觀察到相反變化［8］，這表明Snail可以在一定程度上反映腫瘤細胞的侵襲能力，是上皮性腫瘤EMT過程中的一個重要調(diào)節(jié)因素。因此，本實驗將Snail真核表達載體pCDNA3.1-Snail轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細胞;對轉(zhuǎn)染后的細胞采用阿霉素誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)后的細胞進行細胞毒性實驗，結(jié)果顯示MCF-7/ADM100細胞和MCF-7/Snail-ADM100細胞的相對耐藥指數(shù)分別為32.1和109.2，MCF-7/Snail-ADM100細胞耐藥性明顯升高;阿霉素外排實驗顯示MCF-7/Snail-ADM100細胞中藥物濃度降至7.1，相對MCF-7/ADM100細胞明顯降低，說明藥物外排能力提高;兩次試驗結(jié)果與流式細胞術(shù)和Real-time PCR所顯示的P-gp表達增多和MDR1 mRNA表達增多的結(jié)果相一致。實驗結(jié)果表明Snail與P-gp的表達相關(guān)，因此，在腫瘤進展過程中兩者的發(fā)生并不是一個孤立事件，它們之間可能存在密切聯(lián)系。

Fig 5 The mRNA relative level of Snail and MDR1

Yan等［9］的研究表明通過激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可導(dǎo)致細胞發(fā)生EMT變化;也有研究表明PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活能上調(diào)P-gp的表達，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生MDR［10］。此外，在對信號傳導(dǎo)通路的研究中還發(fā)現(xiàn)，激活MAPK通路也能導(dǎo)致細胞 EMT的變化和耐藥的發(fā)生［11，12］。這說明EMT和MDR的發(fā)生過程可能存在多種共同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些信號通路在兩者發(fā)生的機制中可能起到了某種作用。另外，低氧環(huán)境作為惡性腫瘤生長的必要環(huán)境和導(dǎo)致EMT的重要因素，同時也能上調(diào) P-gp 的表達［13，14］。這進一步說明了 EMT 與MDR之間可能存在共同激活的機制。然而，EMT和MDR的發(fā)生機制復(fù)雜，兩者相互作用的機制尚需進一步的研究。

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