周曉隆，陳志武

在腦缺血/再灌注損傷過(guò)程中，由于細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致大量的自由基產(chǎn)生，造成腦細(xì)胞損傷的加重。金絲桃苷(hyperin，Hyp)為黃酮醇苷類化合物，我們以前的研究表明［1，2］Hyp 有多種藥理活性，可以抑制自由基脂質(zhì)過(guò)氧化和鈣超載，有一定的抗腦缺血/再灌注損傷作用［3～5］。有研究表明［6］Hyp 對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧/再給氧損傷有一定的保護(hù)作用，本研究探討了Hyp對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧/再給氧損傷保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑 Hyp由安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所制備，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.0%;尼莫地平(nimodipine，Nim)由新華制藥廠出品;Fura 2-AM購(gòu)自Sigma公司;胰蛋白酶、胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為市售分析純。

1.2 動(dòng)物 新生1～3 d的SD大鼠，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)第01號(hào)。

2 方法

2.1 新生大鼠腦細(xì)胞懸液的制備［7，8］無(wú)菌條件下取新生1～3 d大鼠的前腦，立即置冰D-Hank's液中，仔細(xì)剝離剔除軟腦膜和血管，用冰Hank's液洗滌3次，在D-Hank's液(無(wú)鈣、無(wú)鎂)中剪成糜狀，吸除D-Hank's液，加入0.125%胰蛋白酶于37℃消化15 min，并不時(shí)予以搖動(dòng)。用2倍量的RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中止消化，離心(1 000 r·min－1，×5 min)棄上清液，加 RPMI 1640培養(yǎng)液重新離心1次，以洗凈胰蛋白酶。用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L－1，置入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞成活率達(dá)95%以上可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 腦細(xì)胞缺氧/再給氧損傷模型［8，9］將上述細(xì)胞懸液(需測(cè)［Ca2+］i者，則加入 Fura-2 AM)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中 40 min 后，離心(1 000 r·min－1，×5 min)，用Hank's液洗2 次，換入原體積純N2飽和30 min的無(wú)糖Hank's液(含0.2%胎牛血清蛋白)，在培養(yǎng)管通入l L·min－1N240 s以驅(qū)除管內(nèi)O2，同時(shí)輕輕吹打分散細(xì)胞，加塞密封(測(cè)［Ca2+］i者，則直接移入熒光測(cè)試杯中，用四周涂有少許凡士林的杯蓋密封)，置37℃溫育。30 min后，分別測(cè)定［Ca2+］i或離心(3 000 r·min－1，×5 min)后取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用化學(xué)比色法、硫代巴比妥酸鹽法及硝酸還原酶法分別測(cè)定LDH、MDA 及 NO 含量［8］。

再給氧模型按上法制備缺氧30 min的細(xì)胞懸液，離心(1 000 r·min－1，× 5 min)，換入正常的Hank's液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中(需測(cè)［Ca2+］i者，則加入Fura-2 AM)進(jìn)行再給氧40 min，然后離心，取上清液測(cè)LDH、MDA及NO或用含0.2%胎牛血清蛋白的 Hank's洗2次并重新懸浮細(xì)胞行［Ca2+］i測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)設(shè)假缺氧組(Sham)、對(duì)照組(Control)、陽(yáng)性對(duì)照組(Nim)及 Hyp 1.0、4.0 和 16.0 μmol·L－13個(gè)濃度組，共5大組，各大組再分為缺氧組和缺氧/再給氧組。Sham組除不缺氧外，實(shí)驗(yàn)程序及處理與其他各組一樣。用藥組在缺氧及再給氧期間均加入Nim或Hyp。

2.3 腦細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+濃度(［Ca2+］i)的測(cè)定［7，11］將終濃度為 5 μmol的 Fura2-AM 加入細(xì)胞懸液中，37℃溫育 40 min負(fù)載 Fura 2后，離心(1 000 r·min－1，×5 min)，棄上清液，沉淀用含0.2%胎牛血清蛋白的Hank's液洗2次并重新調(diào)成1 ×109·L－1，測(cè)定前細(xì)胞在 37℃復(fù)溫 3 min。

用Hitchi 650-60熒光分光光度儀(λex:340 nm，λem:500 nm)測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞懸液熒光值(F)、加入終濃度為0.1%TritonX-100后的最大熒光值(Fmax)及加入終濃度為10 mmol·L－1EGTA后的最小熒光值(Fmin)。［Ca2+］i含量按公式:［Ca2+］1=Kd×(F-Fmin)/(Fmax-F)來(lái)計(jì)算，其中 Kd為 Fura 2與 Ca2+的解離常數(shù)，為224 nmol·L－1。

缺氧細(xì)胞組的F需校正可能因缺氧致細(xì)胞膜透性增加引起的Fura 2少量外漏產(chǎn)生熒光的影響，故每次另測(cè)一份同條件的缺氧細(xì)胞懸液加入終濃度為 20 μmol·L－1的 MnCl2(以淬滅細(xì)胞外熒光)前、后的熒光值，以加入MnCl2后熒光值與加入前熒光值的比值乘以實(shí)驗(yàn)組缺氧細(xì)胞實(shí)測(cè)熒光值來(lái)校正。

3 結(jié)果

3.1 Hyp對(duì)缺氧/再給氧誘導(dǎo)的腦細(xì)胞損傷的影響 結(jié)果如Tab 1所示，缺氧明顯地增加細(xì)胞上清液中LDH的含量，缺氧/再給氧對(duì)細(xì)胞上清液中LDH和MDA含量均有明顯增加，表明缺氧/再給氧可引起腦細(xì)胞的損傷。與5.0 μmol·L－1Nim一樣，Hyp 在 1.0 ～16.0 μmol·L－1范圍內(nèi)，可濃度依賴性抑制缺氧/再給氧誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液中LDH和MDA含量的增加。

Tab 1 Effect of Hyp on anoxia/reoxygenation-induced rat cerebral cell injury(ˉ ± s，n=6)

Tab 1 Effect of Hyp on anoxia/reoxygenation-induced rat cerebral cell injury(ˉ ± s，n=6)

##P<0.01 vs sham;*P<0.05，**P<0.01 vs control

Group Concentration/μmol·L－1 LDH/U·L －1 Anoxia Reoxygenation MDA/μmol·L －1 Anoxia Reoxygenation Sham － 62.0±13.0 45.6±9.2 8.6±0.9 9.1±0.9 Control － 116.0±16.6## 106.0±17.4## 8.6±1.4 16.4±2.7##Nim 5.0 72.8±11.0** 64.0±13.2** 9.1±1.8 11.4±2.7*Hyp 1.0 111.2±13.4 98.8±19.8 9.0±2.7 15.0±2.0 4.0 70.4±13.6** 79.6±12.8* 9.1±2.3 12.3±2.3*16.0 59.2±10.8** 56.0±10.5** 9.5±2.7 10.4±1.8**

Tab 2Effect of Hyp on anoxia/reoxygenation-induced NO release from rat cerebral cell(μmol·L－1，ˉ±s，n=6)

Tab 2Effect of Hyp on anoxia/reoxygenation-induced NO release from rat cerebral cell(μmol·L－1，ˉ±s，n=6)

##P<0.01 vs sham;*P<0.05，**P<0.01 vs control

Group Concentration/μmol·L －1 Anoxia 5 min 15 min 30 min Reoxygenation 40 min Sham － 22.9±6.2 21.8±6.1 20.8±8.3 25.0±6.0 Control － 49.0±9.4## 59.4±14.6## 57.3±7.3## 34.4±6.3##Nim 5.0 33.4±7.3* 39.6±12.5* 38.5±10.5** 25.0±4.2*Hyp 1.0 43.7±8.3 51.0±12.5 53.1±9.4 31.2±5.2 4.0 34.4±6.2* 42.7±6.2* 41.7±6.1** 27.1±4.2 16.0 29.2±8.3** 32.3±10.4** 32.2±5.2** 25.0±5.1*

3.2 Hyp對(duì)缺氧/再給氧誘導(dǎo)的腦細(xì)胞釋放的NO的影響 結(jié)果如Tab 2所示，缺氧和缺氧/再給氧可明顯地增加細(xì)胞上清液中NO含量，表明缺氧/再給氧可引起細(xì)胞NO釋放的增加。Hyp在1.0～16.0 μmol·L－1范圍內(nèi)，可明顯地抑制缺氧/再給氧引起的細(xì)胞NO釋放的增加，并呈一定的濃度依賴性。5.0 μmol·L－1Nim 有類似的作用。

Tab 3Effect of Hyp on anoxia/reoxygenation-induced change of［Ca2+］iin rat cerebral cell(nmol·L－1±s，n=6)

Tab 3Effect of Hyp on anoxia/reoxygenation-induced change of［Ca2+］iin rat cerebral cell(nmol·L－1±s，n=6)

##P<0.01 vs sham;*P<0.05，**P<0.01 vs control

Group Concentration/μmol·L －1 Anoxia 2～3 min 5 min 15 min 30 min Reoxygenation 40 min Sham － 210±33 209±60 215±36 217±31 208±40 Control － 504±60## 546±69## 502±87## 484±125## 640±94##Nim 5.0 270±67** 269±52** 329±67** 327±67* 302±34**Hyp 1.0 464±63 531±81 542±29 450±42 594±101 4.0 396±45* 400±49* 414±49 423±81 454±87*16.0 260±29** 286±63** 286±63** 321±54* 331±56**

3.3 Hyp對(duì)缺氧/再給氧誘導(dǎo)的腦細(xì)胞［Ca2+］i增加的影響 結(jié)果如Tab 3所示，缺氧明顯地引起腦細(xì)胞［Ca2+］i的增加，缺氧后再給氧則進(jìn)一步增加腦細(xì)胞［Ca2+］i。在 1.0 ～16.0 μmol·L－1范圍內(nèi)，Hyp可濃度依賴性抑制缺氧及再給氧引起的腦細(xì)胞［Ca2+］i的增加，5.0 μmol·L－1Nim 有類似的作用。

4 討論

缺氧/再給氧時(shí)，由于脂質(zhì)過(guò)氧化及能量缺乏等因素，腦細(xì)胞膜受到損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，使細(xì)胞內(nèi)的一些重要的酶如LDH等大量的外漏釋放。本研究中缺氧和再給氧對(duì)照組中腦細(xì)胞上清液中的LDH明顯增加，表明腦細(xì)胞有損傷，發(fā)生了明顯的LDH外漏釋放，而Hyp在1.0～16.0 μmol·L－1范圍內(nèi)，可濃度依賴性抑制缺氧/再給氧損傷引起的腦細(xì)胞LDH外漏釋放，這與彭國(guó)平等［6］報(bào)道Hyp可阻斷缺氧和再給氧引起的神經(jīng)元細(xì)胞MTI比色吸光度值的下降及抑制LDH的釋放是一致的。因此，我們的結(jié)果支持Hyp對(duì)腦細(xì)胞缺氧/再給氧損傷有保護(hù)作用。

MDA為自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，也是細(xì)胞損傷的一個(gè)重要指標(biāo)。有資料表明脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)啟動(dòng)于缺氧期，但明顯的過(guò)氧化反應(yīng)卻表現(xiàn)于再給氧期［12］。這是因?yàn)樽杂苫闹|(zhì)過(guò)氧化的特點(diǎn)是連鎖反應(yīng)，反應(yīng)后一階段需要大量的O2才能完成，因缺氧期乏氧，而再給氧期則有充足O2的供給，可使脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)得以進(jìn)行。我們以前的研究表明［5］在四血管結(jié)扎導(dǎo)致的大鼠全腦缺血期間，腦組織中只有氧自由基增多，MDA含量無(wú)明顯的變化;但腦缺血/再灌注期間MDA卻有明顯的增多，Hyp可明顯抑制MDA的增多［3］。本研究發(fā)現(xiàn)腦細(xì)胞缺氧期間MDA含量變化也不明顯，但再給氧期間MDA含量有明顯的增多，這與文獻(xiàn)資料及我們以前在腦缺血及再灌整體動(dòng)物模型上結(jié)果是一致的。本研究在細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)Hyp對(duì)再給氧期間MDA含量的增多有抑制作用，這不僅進(jìn)一步說(shuō)明Hyp對(duì)腦細(xì)胞缺氧/再給氧損傷有保護(hù)作用，也提示著其作用可能與抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

目前研究表明［3］腦缺血/再灌注可致NO釋放的增多。雖然生理劑量的NO可擴(kuò)張腦血管，對(duì)腦有保護(hù)作用，但NO也是一種自由基，大量增多對(duì)細(xì)胞有損傷作用，使腦缺血損傷加重［13］。本研究表明在缺氧和再給氧期間，腦細(xì)胞釋放NO均升高，而Hyp可抑制缺氧/再給氧誘導(dǎo)的腦細(xì)胞NO釋放的增加，提示抑制NO的釋放可能是Hyp對(duì)腦細(xì)胞缺氧/再給氧損傷產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制之一。

細(xì)胞內(nèi)鈣超載是腦細(xì)胞缺血/再給血損傷的重要機(jī)制，降低細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i可產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究表明Hyp可以濃度依賴性的抑制缺氧/再給氧誘導(dǎo)腦細(xì)胞［Ca2+］i的增加，這與我們以前報(bào)道的Hyp可抑制高鉀、去甲腎上腺素、5-HT及谷氨酸等引起的神經(jīng)細(xì)胞［Ca2+］i的增高是一致的［11］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Hyp對(duì)腦細(xì)胞缺氧/再給氧損傷有保護(hù)作用，其作用可能與抑制NO的釋放、鈣超載及抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)，至于其更深入的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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