齊洪濤，劉志華，蔣 彬，鄒 操，趙彩明，李紅霞，韓蓮花，蔣庭波，宋建平，蔣文平

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇蘇州 215006;2.青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院心功能科，山東青島 266042)

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptor，PPAR)是核甾體激素受體，能被脂肪酸以及外源性過氧化體增殖物激活劑激活，調(diào)控參與脂類代謝的某些酶的基因表達［1］，同時PPARs的激活對一些細胞的生長、分化、凋亡有重要影響［2］。最近的研究顯示PPARγ對心肌肥厚具有抑制作用，PPARγ激活能改善左室重構(gòu)和恢復(fù)心功能，抑制心肌細胞肥大和纖維化。PPARγ滅活，導(dǎo)致心肌肥厚。PPARγ對心室重構(gòu)的影響，主要與降低核因子 κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活性有關(guān)。NF-κB是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多向調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子，在心肌肥厚、心肌細胞凋亡、心力衰竭的發(fā)生中，NF-κB發(fā)揮重要作用，NF-κB的過分表達導(dǎo)致心肌細胞肥大。近期研究證明，PPARγ對NF-κB有負向調(diào)節(jié)關(guān)系［3］，他汀類藥物對PPARγ有激活作用，并通過激活PPARγ抑制NF-κB活性，抑制心肌肥厚［4，5］。本研究觀察了辛伐他汀對PPARγ mRNA及蛋白表達的影響，及辛伐他汀對NF-κB亞基p65蛋白表達及活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只新西蘭白兔均來自蘇州大學(xué)實驗動物中心，♀♂不拘，體重1.8～2.8 kg，分為4組，每組6只，1組:假手術(shù)組;2組:心衰對照組，術(shù)后觀察8 wk。3組:早干預(yù)組，手術(shù)后給予辛伐他汀(Merck Sharp＆Dohme Ltd產(chǎn)品，杭州默沙東公司分裝)5 mg·kg-1·d-1，采用灌胃方法給藥，連續(xù)服8 wk。4組:晚干預(yù)組，術(shù)后4 wk給予辛伐他汀5 mg·kg-1·d-1，灌胃方法給藥，連續(xù)4 wk。

1.2 心臟前后負荷增加模型制作 通過破壞主動脈瓣造成主動脈瓣返流，2 wk后實施腹主動脈縮窄術(shù)，制作前、后符合增加心力衰竭模型［6］。心臟超聲檢查:于主動脈瓣破壞后及觀察結(jié)束時，做心臟超聲檢查，用12 Hz專用探頭，做M超及彩色多普勒超聲，觀察左心室內(nèi)徑及室壁厚度、左室射血分數(shù)(EF)、左室長軸縮短率(FS)，破瓣后主動脈瓣返流情況。實驗觀察終止時，再次手術(shù)，分離另一側(cè)頸總動脈，測量左室舒張末壓。取出心臟稱全心及左室重量，計算心臟重量/體重、左室重量/體重。左心室組織放液氮中儲存。

1.3 測定蛋白濃度 用德國Merck KgaA ProteoExtract?Subcellular proteome Extraction Kit提取心肌組織細胞核蛋白。Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)測定蛋白濃度。

1.4 Western blot檢測細胞核PPARγ、p65蛋白表達 PPARγ、p65蛋白分子量均為65 ku，配制10%分離膠。膠凝固后，配制5%的濃縮膠。分別取80 μg細胞膜蛋白加5×上樣緩沖液2 μl，沸水變性5 min。將樣品蛋白及預(yù)染蛋白Marker加入上樣孔，電泳、轉(zhuǎn)膜。免疫反應(yīng):用封閉液稀釋一抗到要求濃度，抗 PPARγ(5 mg·L-1)，抗 p65(10 mg·L-1)，抗β-actin(1∶500)。將膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。將膜放入二抗稀釋液，室溫下在搖床上孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光，顯影，定影。圖像分析用掃描儀將X光片圖像掃至電腦，用UVIDoc軟件進行條帶灰度分析，計算每標本PPARγ、p65與β-actin灰度比。

1.5 RT-PCR檢測心肌組織PPARγ mRNA表達每一標本取100 mg心肌組織，用TRIzol提取mRNA，室溫干燥，測A260/A280值。用美國Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒做逆轉(zhuǎn)錄。擴增:將PCR管置于冰上，建立下列反應(yīng)體系:10 × buffer 2.5 μl，MgCl22 μl，Tag 酶 0.25 μl，dNTP 0.5 μl，10 mmol·L-1引物(S)0.625 μl，10 mmol·L-1(A)0.625 μl，模板 2 μl，加DEPC 水至25 μl。引物:PPARγ 上游:5′-TTCCTGTCAAGATCGCCCTCG-3′;下 游:5′-TGGGGATGTCTCATAATGCCA-3′。β-actin 上游:5′-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG-3′;下游:5′-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT-3′。擴增條件為94℃預(yù)變性4 min，然后，94℃變性 1 min，55℃退火1 min，72℃延長1 min 20 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。電泳及圖像分析:用Bio Rad凝膠成像系統(tǒng)quantity one軟件分析條帶灰度，計算每一樣本PPARγ mRNA灰度與βactin mRNA灰度比。

1.6 電泳遷移率變動試驗(EMSA)檢測心肌細胞核p65活性 用Subcellular proteome Extraction Kit(Merck KgaA ProteoExtract?，German)提取細胞核蛋白。用含NF-κB核苷酸同序列(5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′)結(jié)合位點的寡核苷酸完成電泳遷移率變動試驗。在下列反應(yīng)中完成寡核苷酸標記:2 μl寡核苷酸(1.75 pmol/Al)，2 μl T4 多核苷酸激酶緩沖液，1 μl T4多核苷酸激酶(10 U/Al)，2.5 μl［γ-32P］ATP(185 TBq/mmol at 370 MBq/ml)，37℃孵育1 h。加入90 μl TE 緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4 and 1 mmol·L-1EDTA)。10 μg核蛋白在冰上加入緩沖液(10 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，25 mmol·L-1KCl，0.5 mmol·L-1DTT，0.1 mmol·L-1EDTA pH 8.0，5%glycerol，5 g·L-1BSA，100 mg·L-1tRNA and 50 mg·L-1poly(dI-dC))，反應(yīng) 10 min，然后加入 15 μl標記探針(約60.000 cpm)，4℃孵育15 min。同時完成特異性競爭試驗。在標記探針加入前先加入未標記同序列競爭核苷酸。在標記探針4℃孵育前加入p65抗體，然后將蛋白-DNA復(fù)合物4℃ 5%的聚丙酰胺電泳，將膠放在濾紙上，干燥后，用磷屏壓膠1 h，用磷屏掃描儀檢測32P放射量，掃描磷屏，用ImageQuant軟件分析各標本圖像中32P放射量。

2 結(jié)果

2.1 4組心臟、左心室重量及心臟/體重、左心室/體重比較 心力衰竭對照組心臟重量、左心室重量、心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)均大于假手術(shù)組，早干預(yù)組上述指標均低于心力衰竭對照組，晚干預(yù)組心臟重量、左心室重量、心臟重量指數(shù)低于心力衰竭對照組，見Tab 1。

2.2 4組觀察開始及結(jié)束時左室最大舒張壓比較實驗開始時，各組左室舒張末壓(LVEP)無差異。實驗終止時，心衰對照組高于假手術(shù)組，早、晚干預(yù)組LVEP均低于心衰對照組，見Tab 2。

Tab 2 Change after heart failure and effect of simvastatin on LVEDP±s，n=6)

Tab 2 Change after heart failure and effect of simvastatin on LVEDP±s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅡ;ΔΔP＜0.01 vs groupⅠ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣbegin of experiment -2.50±1.41 -3.00±1.65 -2.00±0.63 -2.50±1.52 end of experiment -0.50±1.34** 14.00±2.67ΔΔ 0.33±1.97**2.33±1.89**

2.3 4組心肌組織PPARγ mRNA表達比較 與假手術(shù)組比較，心力衰竭組PPARγ mRNA表達降低，辛伐他汀干預(yù)后，PPARγ mRNA表達明顯增加，且早干預(yù)組表達增加比晚干預(yù)組更加明顯，見Tab 3及Fig 1。

Tab 3 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression(±s，n=6)

Tab 3 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression(±s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅠ;△△P＜0.01 vs groupⅡ;#P＜0.05 vs groupⅣ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣPPARγ mRNA 0.720±0.018 0.308±0.010**0.522±0.009△△#0.448±0.024△△

2.4 4組心肌組織細胞核PPARγ蛋白表達的比較

心衰組PPARγ表達低于健康對照組，經(jīng)辛伐他汀治療后，早干預(yù)組及晚干預(yù)組PPARγ蛋白表達增加(P＜0.01，P＜0.01)。早干預(yù)組PPARγ蛋白表達比晚干預(yù)組增加明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見Tab 4，F(xiàn)ig 2。

Fig 1 RT-PCR of cardiomyocyte nuclear PPARγ mRNA expression in four groups(n=6)

Tab 4 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression(±s，n=6)

Tab 4 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression(±s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅠ;△△P＜0.01 vs groupⅡ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣPPARγ protein 0.819±0.038 0.403±0.016**0.638±0.017△△0.587±0.021△△

Fig 2 Western Blot of cardiomyocyte nuclear PPARγ protein expression in four groups(n=6)

2.5 4組心肌組織細胞核NF-κB亞基p65蛋白表達的比較 心力衰竭組心肌細胞和中p65表達明顯增加，辛伐他汀干預(yù)后p65表達降低，早干預(yù)組表達比晚干預(yù)組降低更明顯，但未達到統(tǒng)計學(xué)意義，見Tab 5，F(xiàn)ig 3。

Tab 5 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 protein expression( ± s，n=6)

Tab 5 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 protein expression( ± s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅠ;△△P＜0.01 vs groupⅡ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣp65 0.417±0.013 0.715±0.038**0.491±0.015△△0.537±0.032△△

Tab 1Changes after heart failure and effects of simvastatin on HW，LVW，HW/BW radio and LVW/BW(±s，n=6)

Tab 1Changes after heart failure and effects of simvastatin on HW，LVW，HW/BW radio and LVW/BW(±s，n=6)

*P＜0.05，**P ＜0.01 vs groupⅡ;ΔΔP＜0.01 vs groupⅠ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣHeart weight/g 4.95±0.42** 11.02±0.53ΔΔ 6.07±0.55** 8.45±0.41*LV weight/g 3.52±0.35** 7.67±0.34ΔΔ 4.19±0.38** 6.29±0.36**HW/BW radio/g·kg-1 2.40±0.23** 4.45±0.35ΔΔ 2.73±0.27** 3.32±0.17*LVW/BW/g·kg-1 1.70±0.20** 3.12±0.28ΔΔ 1.87±0.13**2.47±0.15

Fig 3 Western Blot of cardiomyocyte nuclear p65 protein expression in four groups(n=6)The p65 protein expression of cardiomyocyte nuclear was increased in failure heart(groupⅡ)，simvastatin inhibited the p65 protein expression of cardiomyocyte nuclear(groupⅢ，groupⅣ)

2.6 4組心肌組織細胞核NF-κB亞基p65活性比較 心力衰竭組心肌細胞核p65活性明顯增強，給予辛伐他汀干預(yù)后p65活性明顯降低，早干預(yù)組表達降低比晚干預(yù)組更加明顯，見Tab 6，F(xiàn)ig 4。

Tab 6 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 activity(±s，n=6)

Tab 6 Change after heart failure and effect of simvastatin on cardiomyocyte nuclear p65 activity(±s，n=6)

**P＜0.01 vs groupⅠ;△△P＜0.01 vs groupⅡ;#P＜0.05 vs groupⅣ

GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣp65 2464.97±130.09 6922.76±358.44**2897.18±263.71△△#4368.54±180.62△△

Fig 4 EMSA of cardiomyocyte nuclear p65 activity in four groups(n=6)The p65 activity of cardiomyocyte nuclear was increased in failure heart(groupⅡ)，simvastatin inhibited the p65 activity of cardiomyocyte nuclear(groupⅢ，groupⅣ)

3 討論

成年心臟心肌代謝主要依靠線粒體氧化長鏈脂肪酸，參與脂肪氧化酶的基因受PPARs調(diào)節(jié)［7］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚與心肌代謝發(fā)生改變、脂肪氧化減少，葡萄糖氧化增加有關(guān)，而這樣的代謝為胎兒心肌的代謝特點。這一變化被認為是為減少耗氧而發(fā)生的適應(yīng)性反應(yīng)，但因受損的脂肪酸氧化而導(dǎo)致脂質(zhì)在心臟沉積，并導(dǎo)致心肌肥厚［8］。

許多研究顯示PPARγ對心肌肥厚、心肌纖維化具有抑制作用，抑制細胞表面積增大及心肌肥厚相關(guān)基因的表達。抑制心肌肥厚及間質(zhì)纖維化，改善心肌重構(gòu)。Yuan等［9］在大鼠中研究顯示，PPARγ抑制心肌細胞增長、胚胎基因表達，并抑制NF-κB的活性。Yamamoto等［10］在研究中也發(fā)現(xiàn)，PPARγ激活抑制NF-κB激活，抑制心肌肥厚發(fā)生。

核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有基因轉(zhuǎn)錄多向調(diào)控作用的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB存在于血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞及心肌細胞，在心肌肥厚、心肌細胞凋亡、心力衰竭的發(fā)生中，發(fā)揮重要作用［11］。內(nèi)分泌-細胞因子引起的心室重構(gòu)、心室肥厚的信號通路最終都經(jīng)過NF-κB［12］。

近期研究證明［13］，他汀類藥物對抑制心室重構(gòu)，改善心功能有重要作用，其機制與激活PPARγ［14，15］，抑制 NF-κB 活性有關(guān)。Delerive 等［15］在研究中發(fā)現(xiàn)，PPARα與NF-κB亞單位p65第12-317號氨基酸有弱的相互作用，通過蛋白-蛋白作用，PPARα 對 NF-κB 產(chǎn)生抑制作用。Planavila等［16］研究也發(fā)現(xiàn)，在壓力負荷增加導(dǎo)致的心肌肥厚過程中，Atorvastatin干預(yù)抑制了NF-κB激活，并防止了PPARs蛋白表達降低，抑制心肌肥厚的發(fā)生。

與以往研究結(jié)果相似［5，15］，本研究結(jié)果顯示在壓力負荷及容量負荷增加導(dǎo)致的心力衰竭心肌組織中，心肌細胞核PPARγ蛋白表達較假手術(shù)組明顯減少，RT-PCR分析顯示心力衰竭心肌組織細胞核中PPARγ mRNA表達降低，而心肌細胞核NF-κB亞基p65蛋白表達增加，電泳移動轉(zhuǎn)變分析(EMSA)顯示，心力衰竭心肌組織中，p65活性較健康對照明顯增強。表明PPARγ表達減少，對心肌肥厚的抑制作用減弱，導(dǎo)致心肌肥厚發(fā)生，p65表達增加、活性增強是心肌肥厚的重要原因，PPARγ與p65存在負向調(diào)節(jié)關(guān)系。辛伐他汀干預(yù)后 PPARγ mRNA、蛋白表達增加，細胞核p65表達減少，活性降低，表明辛伐他汀通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，提高PPARγ表達，PPARγ表達增加抑制p65表達及活性，從而對心肌肥厚產(chǎn)生影響。比較早干預(yù)組與晚干預(yù)組發(fā)現(xiàn)，早干預(yù)使PPARγ mRNA表達增加比晚干預(yù)組更加明顯，且早干預(yù)組對p65活性抑制比晚干預(yù)組更強。

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