孟金蘭，蘭愛平，楊春濤，楊戰(zhàn)利，王立偉，陳麗新，朱琳燕，陳培熹，馮鑒強(qiáng)

近年的研究表明［1］，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為一種新型的氣體信號(hào)分子，不僅具有神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用，而且也被視為一種重要的生理性保護(hù)成分，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。H2S不僅可保護(hù)鼠大腦皮層神經(jīng)元對(duì)抗氧化應(yīng)激的損傷［2］;亦具有抗神經(jīng)元凋亡的作用［3，4］。有趣的是，當(dāng)小鼠吸入H2S后能降低體內(nèi)代謝約90%，然后進(jìn)入“假死”狀態(tài)［5］，由此而保護(hù)小鼠對(duì)抗隨后致命的缺氧損傷［6］。但是H2S能否保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)性缺氧引起的損傷尚未明確。

熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)是細(xì)胞受到各種理化因素刺激(包括缺氧)后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的一組保護(hù)性蛋白，包括Hsp90、Hsp70和Hsp40等。這些蛋白廣泛存在于生物界的原核及真核生物細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)其多種靶蛋白(包括存活和凋亡因子)的折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［7］。在缺氧條件下，Hsp90的表達(dá)上調(diào)可對(duì)抗心肌缺血/再灌注引起的損傷［8］。應(yīng)用Hsp90抑制劑抑制其表達(dá)可增加心肌的缺血/再灌注損傷［9］，然而，H2S抗化學(xué)性缺氧的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用是否與Hsp90信號(hào)通路有關(guān)，Hsp90在其中起何作用還不清楚。由此，本研究應(yīng)用CoCl2(一種化學(xué)性低氧模擬劑)損傷具有神經(jīng)元形態(tài)和功能特征的來(lái)源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤的PC12細(xì)胞，以建立化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，擬探討H2S能否對(duì)抗CoCl2引起的PC12細(xì)胞損傷及Hsp90在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 NaHS、氯化鈷、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)、Hoechst 33258 購(gòu)自美國(guó) Sigma Aldrich公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Lab，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。PC12細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組:① 空白對(duì)照組(Control);② NaHS預(yù)處理組(PC):單獨(dú)應(yīng)用400 μmol·L－1NaHS處理PC12細(xì)胞3 h;③ CoCl2損傷組(CoCl2):應(yīng)用600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞48 h;④ PC+CoCl2;⑤ 17-AAG+PC+CoCl2:在應(yīng)用 NaHS 前30 min，用2 μmol·L－1Hsp90 抑制劑17-AAG處理細(xì)胞30 min，其余的實(shí)驗(yàn)步驟與④ 組相同;⑥ 單獨(dú)17-AAG 組(17-AAG):應(yīng)用2 μmol·L－117-AAG處理PC12細(xì)胞30 min。

1.4 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×104/孔接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，更換為含有不同處理因素的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后各組細(xì)胞分別與CCK-8(每孔 100 μl加 10 μl CCK-8)37℃孵育 4 h，隨后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔的吸收值(λ=450 nm)，按公式:存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD/正常對(duì)照組OD×100%，求出實(shí)驗(yàn)組的存活率，重復(fù)3次。

1.5 Hoechst 33258核染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 把PC12細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，按實(shí)驗(yàn)分組要求給不同的處理因素作用一定時(shí)間后，PBS洗兩次，加入新鮮配制的4%多聚甲醛，4℃固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg·L－1Hoechst 33258試劑，室溫輕搖10 min。在熒光顯微鏡(TE-2000，Nikon，Japan)下攝片，正常細(xì)胞核表現(xiàn)為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，凋亡細(xì)胞核呈濃染致密固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光。隨機(jī)選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

1.6 PI染色流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求給以不同的因素處理后，離心收集細(xì)胞，PBS洗兩次，加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過(guò)夜。用PBS洗兩遍，PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA的含量(激發(fā)波長(zhǎng):488 nm;發(fā)射波長(zhǎng):610 nm)。每樣本計(jì)數(shù)12 000個(gè)細(xì)胞，以DNA組方圖中低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細(xì)胞數(shù)的多少。

1.7 Western blot法檢測(cè)Hsp90的表達(dá) 細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組給以不同的處理因素，離心收集。預(yù)冷的PBS洗滌兩次，加入裂解緩沖液，4℃靜置30 min。12 000×g離心10 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。隨后加入Hsp90抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h，漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色后，用Image J 1.41o進(jìn)行灰度分析，每樣本重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用ˉ±s表示，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 H2S減弱CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 本文在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)證實(shí)600 μmol·L－1CoCl2能明顯地?fù)p傷 PC12 細(xì)胞，因此，本研究中應(yīng)用 600 μmol·L－1CoCl2作為CoCl2的有效損傷濃度。Fig 1顯示，600 μmol·L－1CoCl2作用 PC12 細(xì)胞 24 h，對(duì)細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用，使細(xì)胞存活率降低至(54.13±4.49)%，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。400 μmol·L－1NaHS 預(yù)處理 3 h 能對(duì)抗CoCl2的細(xì)胞毒性作用，使細(xì)胞存活率從(54.13±4.49)%提高至(79.42±3.29)%(P<0.01)。

Fig 1 Effects of different treatments on viability of PC12 cells(n=5)

2.2 H2S抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用 Fig 2的Hoechst 33258染色熒光顯微鏡照相術(shù)檢測(cè)的結(jié)果顯示，正常的PC12細(xì)胞呈現(xiàn)為散在的低強(qiáng)度熒光(Fig 2A)。凋亡細(xì)胞核則呈濃染致密的固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光。600 μmol·L－1CoCl2作用 PC12細(xì)胞48 h，使凋亡細(xì)胞的數(shù)目明顯增多(Fig 2C)。400 μmol·L－1NaHS本身不引起細(xì)胞凋亡(Fig 2B)，但能保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗CoCl2的致凋亡作用，使凋亡細(xì)胞數(shù)量減少(Fig 2D)。與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，流式細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果(Fig 3)顯示，正常時(shí)，PC12細(xì)胞的凋亡數(shù)量很低，CoCl2卻使細(xì)胞凋亡率增加至(38.8 ±1.27)%;400 μmol·L－1NaHS 預(yù)處理能使CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率降低至(15.1±0.47)%(P<0.01)。

Fig 2 Morphological changes in apoptotic cells of differentgroups assessed by Hoechst 33258 staining

2.3 H2S預(yù)處理上調(diào)Hsp90的表達(dá) 給予PC12細(xì)胞 NaHS 預(yù)處理，觀察預(yù)處理后1、3、6、9、12 及 24 h Hsp90的表達(dá)情況。Western blot的檢測(cè)結(jié)果顯示，400 μmol·L－1NaHS預(yù)處理1 h ，可使 PC12 細(xì)胞Hsp90表達(dá)開始升高;在預(yù)處理3 h，Hsp90表達(dá)達(dá)到高峰，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 4);隨后，Hsp90的表達(dá)水平下降，作用24 h后，Hsp90表達(dá)恢復(fù)到對(duì)照水平，提示H2S預(yù)處理對(duì)Hsp90表達(dá)具有促進(jìn)作用。

Fig 3 Effects of different treatments on apoptosis of PC12 cells(n=3)

Fig 4 Effects of H2S preconditioning onexpression of Hsp90 in different time(n=3)

值得注意的是 Fig 5顯示，CoCl2(600 μmol·L－1)也能上調(diào)Hsp90的表達(dá)，而且，H2S預(yù)處理能進(jìn)一步增強(qiáng)CoCl2對(duì)PC12細(xì)胞Hsp90表達(dá)的上調(diào)作用，提示 H2S的細(xì)胞保護(hù)作用可能與其上調(diào)Hsp90有關(guān)。

Fig 5 17-AAG on Hsp90 expression(n=3)

2.4 Hsp90介導(dǎo)H2S抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用 為了探討Hsp90在H2S誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)中的作用，本文在NaHS預(yù)處理前30 min使用Hsp90抑制劑17-AAG(2 μmol·L－1)，觀察對(duì) Hsp90 表達(dá)及NaHS預(yù)處理誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用的影響。

Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，17-AAG可明顯抑制H2S誘導(dǎo)的Hsp90表達(dá)增高。同時(shí)，17-AAG可明顯拮抗H2S的細(xì)胞保護(hù)作用:在NaHS預(yù)處理前30 min加入2 μmol·L－117-AAG 后可使細(xì)胞存活率下降到(55.74±6.47)%(與H2S保護(hù)組相比，P<0.01，F(xiàn)ig 1);使細(xì)胞凋亡率再次回升到(34.5±0.48)%(與 H2S保護(hù)組相比，P<0.01，F(xiàn)ig 3);Hoechst 33258核染色形態(tài)學(xué)結(jié)果亦顯示，17-AAG增加了細(xì)胞凋亡，減弱了H2S的細(xì)胞保護(hù)作用(Fig 2)。

上述結(jié)果提示Hsp90介導(dǎo)了H2S抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用。

3 討論

最近，本實(shí)驗(yàn)室證實(shí)，H2S預(yù)處理能對(duì)抗化學(xué)性缺氧引起的心肌損傷［10］。本文再次證實(shí)，H2S預(yù)處理能保護(hù)具有神經(jīng)元的形態(tài)和功能特征的PC12細(xì)胞對(duì)抗CoCl2引起的損傷作用。表明在不同的細(xì)胞模型，在體實(shí)驗(yàn)或離體實(shí)驗(yàn)，H2S均具有抗缺氧/缺血的細(xì)胞保護(hù)作用，這與曾因明課題組近期的研究結(jié)果相一致［11，12］。

新近研究表明，H2S能抑制缺血/再灌注引起的肝損傷，并增加Hsp90和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提示H2S可通過(guò)上調(diào)Hsp90表達(dá)來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞對(duì)抗缺血/再灌注損傷［13］。Hsp90是一種重要的細(xì)胞保護(hù)蛋白，可對(duì)抗包括缺氧/缺血等各種致死性的因素引起的細(xì)胞損傷［14］。研究表明，在心肌缺血區(qū)Hsp90高表達(dá)可保護(hù)心肌免受缺血/再灌注損傷;同時(shí)，過(guò)表達(dá)Hsp90也可抗心肌缺氧損傷［15］。

然而，Hsp90是否介導(dǎo)H2S抗化學(xué)性缺氧損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，至今未見報(bào)道。為了揭示兩者的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)觀察了400 μmol·L－1H2S供體NaHS作用PC12細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)Hsp90表達(dá)的影響。本文發(fā)現(xiàn)，H2S預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞Hsp90表達(dá)有明顯的上調(diào)作用。表明H2S是一種有效激活保護(hù)性蛋白Hsp90的物質(zhì)，這與 Jha等［13］的研究結(jié)果相一致。

為了進(jìn)一步揭示Hsp90在H2S保護(hù)PC12細(xì)胞抗化學(xué)性缺氧損傷中的作用，本研究在NaHS預(yù)處理前30 min使用Hsp90抑制劑17-AAG。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hsp90抑制劑17-AAG在抑制Hsp90表達(dá)的同時(shí)，能明顯地阻斷H2S的細(xì)胞保護(hù)作用，使PC12細(xì)胞存活率降低及凋亡率增加，提示Hsp90介導(dǎo)H2S誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)為深入闡明H2S的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制提供了新穎的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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