陳玉培，向許進(jìn)，閔 蘇

我們在前期試驗中發(fā)現(xiàn)雷諾嗪后處理(ranolazine postconditioning，RpostC)能改善大鼠離體缺血/再灌注心肌心功能及冠脈流量，降低冠脈流出液中肌酸激酶(CK)與乳酸脫氫酶(LDH)的活性和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(CTnI)的含量，但其作用機(jī)制尚不清楚。研究證實［1］，缺血后處理的抗凋亡作用與其抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開放和激活再灌注損傷營救激酶(reperfusion injurysalvage kinase，RISK)途徑有關(guān)。本研究通過觀察雷諾嗪后處理對大鼠離體缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡、MPTP和RISK途徑的影響，初步探討雷諾嗪后處理心肌保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年SD大鼠，體重180～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

1.2 主要儀器及試劑 離體心臟灌流系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，Ultrospec 2100 pro紫外/可見分光光度儀(美國通用電器)，IMMULITE 2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(天津德普診斷產(chǎn)品有限公司)，PowerPac HC電泳儀、GelDoc凝膠成像系統(tǒng)和quantity one分析軟件(美國 BIO-RAD)。雷諾嗪(ranolazine，092K4708，美國 Sigma 公司)，atractyloside(MPTP 開放劑，029H06461，美國 Sigma)，PD98059(ERK1/2抑制劑，24661-02S，美國 Biosource);wortmannin(Wort，PI3K 抑制劑，L15531，美國 Alexis Biochemicals)，p-P44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)(E10)小鼠單克隆抗體(#9106S，美國Cell Signaling Technology)，p-磷 酸 化-AKT(Ser473)(587F11)小鼠單克隆抗體(#4051S，美國Cell Signaling Technology)，GAPDH人單克隆抗體(bsh-0510M，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(ZB-2305，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 Langendorff心臟灌注模型的建立 SD大鼠腹腔注射 20%烏拉坦 1.0 g·kg－1及肝素鈉1 000 U·kg－1，麻醉后無菌下開胸，快速取出心臟，立即置于預(yù)先用95%O2+5%CO2混合氣體(1.5 L·min－1)飽和的4℃ K-H 緩沖液［成分(mmol·L－1):NaCl 118、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、NaHCO325.0、MgSO41.2、葡萄糖 11.1、EDTA-2Na 0.125］中漂洗并輕輕擠出心臟中的血液;用眼科鑷將主動脈置于Langendorff灌注管口，用絲線固定后行心臟逆行恒壓灌注(灌注壓為為100 cm H2O)。整個操作過程應(yīng)在2 min內(nèi)完成。K-H緩沖液的灌注壓為100 cmH2O、PO266.7 ～73.3 kPa、PCO24.8～5.6 kPa，pH值7.35～7.45。整個灌注系統(tǒng)及心臟周圍用恒溫水浴循環(huán)器維持在(37±0.5)℃，室溫控制在(25±1)℃。灌流開始數(shù)秒內(nèi)心臟即可開始跳動。平衡20 min，心臟搏動達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后開始進(jìn)一步實驗。

1.4 實驗分組與處理 56只成年SD大鼠隨機(jī)分為8組(n=7):①缺血/再灌注組(I/R組):全心停灌30 min，用K-H液再灌注15 min;② 雷諾嗪后處理組(RPostC 組):全心停灌 30 min，用含 20 μmol·L－1雷諾嗪的K-H液再灌注10 min，再用K-H液灌注5 min;③ 雷諾嗪+atractyloside組(RA組):用含20 μmol·L－1雷諾嗪 +20 μmol·L－1atractyloside的K-H液再灌注10 min;④ 雷諾嗪+PD98059組(RP 組):用含 20 μmol·L－1雷諾嗪 +10 μmol·L－1PD98059的K-H液再灌注10 min;⑤ 雷諾嗪+wortmannin(RW 組):用含 20 μmol·L－1雷諾嗪 +1 μmol·L－1wortmannin的 K-H 液再灌注10 min;⑥atractyloside 組(A 組):用含 20 μmol·L－1atractyloside的K-H液再灌注10 min;⑦ P組:用含10 μmol·L－1PD98059的K-H液再灌注10 min;⑧ W組:用含1 μmol·L－1wortmannin的 K-H 液再灌注 10 min。RA組、RP組、RW組、A組、P組、W組的余處理同RPostC組。

1.5 取材 再灌注末，立即從灌注架上取下心臟，在冰盤中取左心室缺血區(qū)組織，將其剪成3塊稱重。1塊用40 g·L－1多聚甲醛固定，檢測心肌細(xì)胞凋亡，另兩塊用鋁鉑紙包好，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 心肌細(xì)胞凋亡檢測 用TUNEL法。將多聚甲醛固定的心肌組織常規(guī)石蠟包埋并作心肌組織切片(5 μm)，切片經(jīng)脫蠟、脫水、DAB顯色后，在光鏡下隨機(jī)拍攝5個400倍視野，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞核染成棕黃色即為凋亡陽性細(xì)胞，計算平均陽性細(xì)胞率，用凋亡指數(shù)(AI)反映心肌凋亡程度(AI=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100)。

1.7 MPTP開放程度檢測［2］用分光光度計法。用差速離心法提取心肌組織線粒體，用280 nm波長測線粒體濃度并調(diào)整線粒體濃度為0.25 g·L－1。平衡2 min后，540 nm波長測吸光度初值(△A1)，加0.25 mmol·L－1CaCl2誘導(dǎo) MPTP 開放，10 min后吸光度不再變化，記錄此時吸光度值(△A2)。用△A=△A1－△A2表示 MPTP開放程度，△A越小，MPTP開放程度越大。

1.8 p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)檢測 用Western blot法，內(nèi)參照為GAPDH。用Bradford方法測定心肌細(xì)胞蛋白含量，取樣品蛋白100μg，經(jīng) SDSPAGE電泳、NC轉(zhuǎn)膜、加入一抗(小鼠抗大鼠 p-AKT、p-ERK1/2或GAPDH單克隆抗體，分別按1∶1 000、1 ∶2 000或1 ∶200)室溫孵育 2 h，PBS洗 5 min×3次，TBS洗5 min×3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫封閉1 h，TBS洗5 min×3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，用GelDoc凝膠成像系統(tǒng)中曝光、成像，Quantity one分析軟件分析條帶密度值，用p-AKT、p-ERK 1、p-ERK 2密度值分別與GAPDH密度值的比值表示蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 雷諾嗪后處理對大鼠離體缺血/再灌注心肌細(xì)胞凋亡和MPTP開放程度的影響 與IR組比較，RPostC組心肌細(xì)胞AI和MPTP開放程度均下降(P<0.05)，其余各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與 RPostC 組比較，RA、RP、RW、A、P 和 W 組AI和MPTP開放程度均升高(P<0.05);與RA組比較，RP、RW、A、P和W組AI和MPTP開放程度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of the AI and the opening of MPTPin each group(ˉ±s，n=7)

Tab 1 Comparison of the AI and the opening of MPTPin each group(ˉ±s，n=7)

*P<0.05 vs I/R group;#P<0.05 vs RPostC group

Group AI/% △A I/R 30.04±1.45 0.14±0.02 RPostC 9.95±1.59* 0.34±0.02*RA 28.24±1.03# 0.12±0.01#RP 26.20±1.61# 0.15±0.01#RW 26.50±1.86# 0.13±0.02#A 28.35±0.62# 0.14±0.01#P 29.12±1.35# 0.15±0.01#W 30.12±1.25# 0.15±0.02#

2.2 雷諾嗪后處理對大鼠離體缺血再灌注心肌細(xì)胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響 與IR組比較，RPostC、RA、RP 和 RW 組 p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，A、P和W組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與 RPostC 組比較，RP、RW、A、P和W組 p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)，RA組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與RA組比較，RP、RW、A、P 和 W 組 p-AKT、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 The expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein in each group(ˉ±s，n=7)

Tab 2 The expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein in each group(ˉ±s，n=7)

*P<0.05 vs IR group;#P<0.05 RPostC group;▲P<0.05 vs RA group

Group p-AKT p-ERK1 p-ERK2 I/R 0.42±0.04 0.84±0.05 0.87±0.03 RPostC 0.66±0.03* 1.02±0.04* 1.00±0.02*RA 0.67±0.03* 1.05±0.06* 1.00±0.03*RP 0.51±0.03*#▲ 0.94±0.02*#▲ 0.94 ±0.02*#▲RW 0.52±0.04*#▲ 0.93±0.02*#▲ 0.94 ±0.01*#▲A 0.42±0.05#▲ 0.84±0.03#▲ 0.89 ±0.02#▲P 0.41±0.05#▲ 0.85±0.05#▲ 0.89 ±0.03#▲W 0.42±0.04#▲ 0.85±0.04#▲ 0.89±0.02#▲

Fig 1 The expression of p-AKT and p-TERK1/2 protein in each group

3 討論

缺血后處理是具有明確保護(hù)效果的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制［3～5］，但其臨床應(yīng)用受限。藥物后處理是用藥物模擬缺血后處理的方式，模擬或者激發(fā)缺血后處理中的心肌保護(hù)機(jī)制或者一些內(nèi)源性而呈現(xiàn)與缺血后出相似的保護(hù)效果，是臨床研究后處理努力的方向。雷諾嗪(ranolazine)是由美國Syntex公司研發(fā)［6］的一種不引起血液動力學(xué)變化，不引起心率和血壓改變的新型抗心絞痛藥，其減輕心肌缺血/再灌注損傷作用已有文獻(xiàn)報道。我們前期研究證實，雷諾嗪后處理具有明顯的心肌保護(hù)效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮最大心肌保護(hù)效應(yīng)的有效濃度為20 μmol·L－1。另有研究表明［7，8］，大鼠離體心再灌注 15 min末，p-AKT明顯增加，因此，本實驗選擇雷諾嗪20 μmol·L－1和再灌注15 min分別作為實驗濃度和觀察時點。本研究發(fā)現(xiàn)，雷諾嗪后處理組的心肌細(xì)胞凋亡和凋亡指數(shù)明顯低于I/R組，表明雷諾嗪后處理具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，與文獻(xiàn)報道一致［9，10］。

MPTP是一個橫跨在線粒體內(nèi)外膜的孔道，在鈣濃度升高和氧化應(yīng)激等因素作用下可以誘導(dǎo)其開放，MPTP開放后，小分子溶質(zhì)自由通過線粒體內(nèi)膜，線粒體基質(zhì)中高濃度大分子蛋白產(chǎn)生膠體滲透壓使水進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹、嵴伸展、外膜破裂，使膜間隙成分如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子、Diablo-SMAC等進(jìn)入胞質(zhì)，進(jìn)一步激活caspase-9和 caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11，12］。本研究發(fā)現(xiàn)，雷諾嗪后處理組較缺血/再灌注組心肌細(xì)胞MPTP的開放程度明顯降低，心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，而用MPTP開放劑atractyloside干預(yù)雷諾嗪后處理后，其MPTP的開放程度明顯升高，心肌細(xì)胞凋亡也明顯增多，提示雷諾嗪后處理抗心肌細(xì)胞凋亡作用與其抑制MPTP開放有關(guān)。

RISK途徑是指在再灌注期間發(fā)揮抗細(xì)胞死亡心臟保護(hù)作用的磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，P13K)-AKT和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERKl/2)前生存激酶的信號級聯(lián)［1］，是再灌注時重要的心肌保護(hù)靶點之一。研究表明［6］，缺血后處理可通過激活RISK途徑，減輕缺血/再灌注心肌的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，雷諾嗪后處理組較缺血/再灌注組p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高，心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，而用 PI3K抑制劑 Wortmmanin和ERK1/2抑制劑 PD9805干預(yù)后，p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯下降，心肌細(xì)胞凋亡明顯增多，提示雷諾嗪后處理的抗心肌凋亡作用與其進(jìn)一步激活RISK途徑有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，用MPTP開放劑atractyloside干預(yù)雷諾嗪后處理組，其心肌細(xì)胞凋亡明顯增多，MPTP開放程度增大，但p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平與雷諾嗪后處理組無差異，提示雷諾嗪后處理的抗心肌凋亡作用可能是先通過激活RISK途徑，再進(jìn)一步抑制MPTP開放實現(xiàn)的，這種作用機(jī)制與缺血后處理的RISK-MPTP機(jī)制極為類似［6］，說明雷諾嗪后處理可以模擬缺血后處理。

綜上所述，雷諾嗪后處理對大鼠離體缺血/再灌注損傷心肌具有明顯的抗凋亡作用，其機(jī)制可能與其激活RISK途徑和抑制MPTP開放有關(guān)。

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