陳文杰，殷嫦嫦，虞蕾琳，李忠友，殷 明

(1.南昌大學 研究生院醫(yī)學部, 江西 南昌 330006；2.南昌大學第二附屬醫(yī)院 骨科, 江西 南昌 330006；3.九江學院 九江市轉化醫(yī)學重點實驗室, 江西 九江 332000；4.九江市中醫(yī)院, 江西 九江 332000)

骨損傷尤其是骨折是臨床的常見病、多發(fā)病，由于缺乏骨再生，即使是輕微骨折也會導致患者的預后不佳。據報道，由于骨再生不足，2%～10%的骨折會發(fā)展成骨不連[1]。因此如何加快骨折愈合、促進骨再生是目前迫切需要解決的問題。然而，現(xiàn)今的治療“金標準”：自體骨和同種異體骨移植可能會導致很多并發(fā)癥。因此，當務之急是找到一種有強大成骨能力且并發(fā)癥發(fā)生率低的治療方法。外排體的成骨能力強、安全性好，這為骨再生提供了一種新的治療方法。

1 骨再生中各類細胞的分工合作

骨是高度血管化的組織，依賴血管和骨細胞之間的密切連接來保持骨骼的完整性，在骨骼發(fā)育和骨折修復中，血管生發(fā)十分重要。此外破骨細胞溶解吸收骨，而骨細胞合成新骨; 骨再生是成骨細胞和破骨細胞的數量和活動動態(tài)平衡的結果，骨重建位點釋放細胞因子，募集破骨細胞，成骨細胞繼續(xù)分化，基質成熟并礦化，骨表面恢復后，成熟的成骨細胞凋亡或最終分化為成骨細胞，其嵌于鈣化基質中響應機械應力[2]。骨再生分為兩種:膜內成骨和軟骨內成骨[3]。膜內成骨是直接通過間充質干細胞向成骨細胞分化導致骨骼鈣化，而軟骨內成骨比較復雜，通過軟骨細胞調節(jié)骨骼的生長和形成，軟骨細胞中心的軟骨停止增殖,開始擴大，合成和釋放X型膠原蛋白質,肥厚性軟骨細胞進行礦化、誘導血管滲透、成骨分化及遷移。除了成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞，內皮細胞對骨再生也有重要的作用。聚集的內皮細胞能分泌VEGF并且指導軟骨細胞消化周圍的細胞基質,最終軟骨細胞凋亡、血管和骨母細胞滲透入細胞基質共同促進骨的生長[4]。此外，骨再生和血管再生是密切相關的，血管再生受損會導致骨再生受損。血管內皮細胞Notch基因敲除后不僅血管生成減少了，骨密度和骨質量也會減少[5]。之前對骨再生的研究主要是針對細胞功能，而細胞間的物質傳遞很少有人涉及。但是，細胞間的物質傳遞對骨再生影響很大。因此，如果能發(fā)現(xiàn)一種增加成骨細胞形成和加強細胞間物質傳遞的治療方法，在未來的臨床治療中將會起到重要作用。外排體，有上述兩種作用，這使之成為研究的熱點。

2 外排體的特性

外排體，來源于內吞作用的一種小囊泡，是一種由真核細胞分泌到細胞外的、直徑約30～100 nm的膜性小囊泡，含有其來源細胞的胞膜、蛋白質、mRNA和微小RNA(miRNA)等成分，通過與鄰近的細胞膜融合進而將一個細胞的胞內物質傳遞到另一個細胞，從而在不同細胞間進行信息傳遞[6]。外排體表面蛋白質TSG101、CD9、CD63、CD81和CD82實現(xiàn)了囊泡與靶細胞膜的連接[7]。外排體傳遞的物質很廣泛，外排體分泌的蛋白質和RNA對調節(jié)受體細胞功能來說是最重要的,外排體中的miRNA在調節(jié)細胞定向分化和活性中發(fā)揮了關鍵的作用[8]。光譜法數據表明外排體中有超過4 000種蛋白質，盡管不同來源的外排體蛋白質的功能不盡相同，但有些蛋白質是所有外排體所共有的。這些共有的蛋白質是細胞間物質傳遞相關蛋白質，如HSP70和HSP90是所有外排體蛋白質運輸的關鍵蛋白質[9]。

3 外排體促進各種器官和組織的再生

外排體的再生作用已經在其他組織和器官中被證實了。經過外排體治療的器官功能明顯改善：在心肌梗死小鼠模型中，經過外排體療法的小鼠心室重構和左心室射血分數可見明顯的改善[10]；外排體能調節(jié)細胞功能，從而促進其再生，在肺動脈高壓的小鼠模型中，外排體療法抑制了病情的進展并且通過細胞保護作用避免了肺損傷；外排體還能促進神經細胞和皮膚再生[11]。外排體不僅能減少細胞的凋亡還能延長細胞的生存周期。這些研究為外排體療法奠定了基礎并為探究其在骨再生中的作用提供了參考。

4 外排體調節(jié)骨再生

4.1 外排體調節(jié)間充質干細胞的成骨分化

外排體直接調節(jié)間充質干細胞的成骨分化。間充質干細胞來源的外排體能誘導干細胞分化為成骨細胞系[12]。研究表明間充質干細胞來源的外排體在成骨分化過程中9種miRNAs (let- 7a、miR- 199b、miR- 218、miR- 148a、miR- 135b、miR- 203、miR- 219、miR- 299- 5p和miR- 302b)的表達上調，5種miRNAs(miR- 221、miR- 155、miR- 885- 5p、miR- 181a和miR- 320c)的表達下調，所有這些miRNA在成骨分化中均起到一定的作用[13]。同時，成骨細胞也能分泌外排體，對骨生長起到正反饋作用，成骨細胞來源的外排體極大的促進了成骨分化，通過抑制Axin1來激活Wnt信號通路，最終促進間充質干細胞的成骨分化[14]。成骨細胞來源外排體中的真核起始因子2也能誘導間充質干細胞分化為成骨細胞[15]。免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)對骨生長有重要的作用，盡管具體的機制還不清楚，但外排體在此過程中可能也起到了一定的作用。樹突細胞和單核細胞來源外排體通過傳遞miRNA顯著地增加了間充質干細胞的成骨分化。然而，哪種細胞來源的外排體促成骨作用最強以及外排體如何調節(jié)間充質干細胞的成骨分化仍有待研究。

4.2 外排體調節(jié)成骨細胞增殖和活性

骨中約4%～6%的細胞為成骨細胞，其主要功能是促進骨的形成。在骨形成過程中，成骨細胞產生鈣磷基礦物進而形成礦化骨。外排體通過調節(jié)成骨細胞的增殖和活性來刺激骨再生。前列腺癌細胞來源的外排體有更強的骨親和性，使成骨細胞增殖加快，用該細胞來源外排體處理過的成骨細胞能產生更多的鈣沉積和更高的ALP(堿性磷酸酶)活性[16]。外排體在體內對成骨細胞的作用也很顯著，骨髓間充質干細胞來源外排體治療后的顱骨缺損兔模型的骨愈合也明顯改善[17]。體內和體外實驗進一步印證了外排體對成骨細胞的重要性。

4.3 外排體調節(jié)破骨細胞成熟和活性

骨再生和破骨細胞的異常激活是密切相關的。腫瘤細胞通過分泌外排體增加成熟破骨細胞的數量和活性，從而誘導骨溶解。多發(fā)性骨髓瘤來源的外排體通過Raw264.7細胞系和人原始破骨細胞的內化增加破骨細胞標志物(cathepsin K, metalloproteinases 9和 TRAP)的表達，從而促進破骨細胞的成熟[18]。前列腺癌來源的外排體能通過刺激NF-κB(RANK)受體活化劑的表達來增加破骨細胞生成[19]。成熟破骨細胞也能通過分泌外排體進行自身調節(jié)，破骨細胞來源的外排體中NF-κB高表達，抑制外排體中NF-κB表達后會導致破骨細胞形成受到抑制[20]。

4.4 外排體促血管生成

盡管沒有研究直接證明外排體在骨中有促血管生成作用，但外排體在其他組織和器官中能刺激血管生成。胚胎間充質干細胞來源的外排體在體外能促進內皮細胞增殖和血管形成，此外還能通過NADH氧化酶、基質金屬蛋白質酶和細胞外基質金屬蛋白質酶誘導因子來增加內皮細胞增殖和血管形成[21]。外排體不僅能在體外促進血管生成，在體內也能增加血管生成能力。間充質干細胞來源的外排體在不同的動物模型中均能提高血管生成能力。尾靜脈注射間充質干細胞來源的外排體能減少心肌缺血和再灌注損傷，在缺血性心臟病動物模型中能提高血管生成能力[22]。

5 外排體療法的優(yōu)勢與不足

5.1 外排體療法的優(yōu)勢

與細胞治療相比，外排體療法有很多優(yōu)勢。外排體療法能避免生物治療所帶來的細胞毒性和免疫抑制問題[23]。外排體能同時正向和負向調節(jié)免疫反應，間充質干細胞來源的外排體對宿主有免疫豁免特性。膠質瘤來源的外排體能激活免疫反應以便于識別膠質瘤細胞，很大程度上有助于新型免疫治療的發(fā)展[24]。另外，和細胞移植相比，外排體療法的并發(fā)癥(腫瘤、血栓形成和GVDH)更少，安全性更強。

5.2 外排體療法的不足

外排體療法應用于臨床仍有很多限制。首先分離外排體的方法產量很低，5×106個骨髓瘤細胞僅能提供5～6 μg外排體；第二，分離外排體的方法仍然很有爭議，傳統(tǒng)超高速離心法操作費時，提取外排體樣本回收率較低，而ExoQuick與TEI試劑盒提取方法僅適用于血清等稀缺樣本外排體制備[25]。但所有這些方法均不適用于臨床；第三，外排體所攜帶基因信息的確切功能還不明確。外排體中miRNA是其主要的功能成分，來源不同，外排體攜帶的物質也不同。了解注射外排體后其在體內的分布對減小外排體的不良反應至關重要，大部分外排體會遷移到骨和肺。因此，必須明確外排體的分布和清除，從而更好的評估其安全性。

6 問題與展望

外排體能刺激成骨細胞生成、調節(jié)血管再生和破骨細胞的活性，在體內和體外均能有效的促進骨再生。但是由于不同來源的外排體作用不一，對靶細胞的具體作用機制不清楚；體外分離產量低以及安全性等問題限制了其在臨床上的應用。因此需要進一步研究外排體在骨再生中具體的作用機制，開發(fā)出有效提取和純化外排體的方法，并探究哪種細胞和組織來源的外排體其成骨能力最強。由于現(xiàn)今治療骨再生的方法費用高、并發(fā)癥多和療效差，外排體療法將在骨再生臨床治療中開辟新的領域。

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