劉瑩 費(fèi)冰 任彥穎 郭夢(mèng)雨 劉心偉 劉冬梅 李永偉

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種革蘭氏陰性非發(fā)酵菌，在自然界中廣泛存在并能耐受惡劣環(huán)境，可引起各種醫(yī)院獲得性感染，包括肺炎、血流感染和囊性纖維化患者的感染，同時(shí)也是囊性纖維化患者的主要致死原因。目前，多重耐藥銅綠假單胞菌感染增加，給臨床治療帶來(lái)困難，所以迫切需要新的抗生素進(jìn)行防治。銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，其中外排泵的過(guò)度表達(dá)促使抗生素從細(xì)胞內(nèi)排出是導(dǎo)致抗生素抗菌活性降低的重要原因。銅綠假單胞菌主要產(chǎn)生抗藥小結(jié)分裂區(qū)（Resistance nodulation division，RND）家族和主要促進(jìn)劑超家族（Major facilitator super，MFS）兩種外排泵，兩者都使用質(zhì)子梯度排出底物。其中RND家族的MexAB-OprM、MexXY-OprM、MexCDOprJ和MexEF-OprN外排泵被認(rèn)為是獲得性多重耐藥的主要原因[1]?，F(xiàn)就國(guó)內(nèi)外多重耐藥銅綠假單胞菌RND外排泵的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，為銅綠假單胞菌的治療提供新思路。

1 RND外排泵的結(jié)構(gòu)及耐藥特點(diǎn)

RND家族外排泵通常存在于革蘭氏陰性菌中，幾乎全部由染色體編碼，由其特有的內(nèi)膜泵蛋白（如MexB）、外膜因子家族的外膜蛋白（如OprM）和膜融合蛋白家族的周質(zhì)輔助蛋白（如MexA）3種成分組成[2]。周質(zhì)輔助蛋白將內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白結(jié)合在一起，形成將底物排出的通道[1，3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌中至少存在12種RND外排泵，在這些已知的RND泵中，MexAB-OprM、MexXYOprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN在臨床上最重要，其中MexAB-OprM和MexXY-OprM外排泵更常見，在臨床分離株中均存在過(guò)表達(dá)，尤其是在囊性纖維化患者和碳青霉烯類耐藥患者中[4]。此外，這幾類外排泵都可能對(duì)抗生素產(chǎn)生可誘導(dǎo)的、不可遺傳的耐藥性[5]。

RND類外排泵功能十分強(qiáng)大，能夠泵出包括抗生素和外源生物物質(zhì)在內(nèi)的多種物質(zhì)，其導(dǎo)致的耐藥特點(diǎn)包括廣泛性耐藥、可誘導(dǎo)性耐藥和低水平性耐藥。廣泛性耐藥是指在包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的所有革蘭氏陰性細(xì)菌中，外排泵通過(guò)改變外膜（Outer membrane，OM）通透性并主動(dòng)將抗菌藥物排出體外的一種防御機(jī)制。由于主動(dòng)外排泵和OM之間的協(xié)同作用，革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜可以非常有效地保護(hù)細(xì)菌免受抗生素的作用，同時(shí)使抗生素緩慢滲透到OM中，從而引起抗生素的有效外流。因此，主動(dòng)外排泵和OM屏障的聯(lián)合作用可以保護(hù)細(xì)胞免受多種化合物的傷害?？烧T導(dǎo)性耐藥是指外排泵機(jī)制在參與天然耐藥的同時(shí)，也可通過(guò)獲得性的誘導(dǎo)使外排泵表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)主動(dòng)外排，已有研究通過(guò)體外藥物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PA可在低劑量、長(zhǎng)時(shí)間抗生素作用后刺激外排泵表達(dá)上調(diào)而產(chǎn)生高水平耐藥[6]。低水平性耐藥是指相對(duì)于水解酶產(chǎn)生、靶點(diǎn)突變或者生物膜形成所需的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）的升高而言，外排泵對(duì)于細(xì)菌MIC的升高是低水平的。

新型抗生素開發(fā)面臨的主要挑戰(zhàn)是通過(guò)改變抗生素的結(jié)構(gòu)以增加其在革蘭氏陰性菌胞內(nèi)的積累量，增大抗菌效率。因此，可以通過(guò)設(shè)計(jì)避免外排機(jī)制發(fā)揮作用的分子，或者使用外排泵抑制劑（Efflux pump inhibitor，EPI）抑制主動(dòng)外排來(lái)減少抗生素通過(guò)OM的泵出，從而提高抗生素的作用效率[7]。

2 RND外排泵的調(diào)節(jié)機(jī)制

銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，外排泵的表達(dá)也受多種因素影響，如群體感應(yīng)系統(tǒng)、底物活性變化以及外排泵基因的過(guò)表達(dá)或突變，均可引起外排泵的過(guò)表達(dá)或者被抑制。4種臨床常見高表達(dá)外排泵中，MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexXY-OprM屬于負(fù)調(diào)節(jié)表達(dá)，分別受負(fù)調(diào)控蛋白MexR、NfxB和MexZ的調(diào)控，編碼基因位于相應(yīng)外排泵編碼區(qū)上游，均與外排泵轉(zhuǎn)錄方向相反。MexEF-OprN屬于正調(diào)節(jié)表達(dá)，受正調(diào)節(jié)蛋白MexT的調(diào)控，編碼基因亦位于外排泵上游，但與之轉(zhuǎn)錄方向一致。MexXY利用MexAB系統(tǒng)的外膜蛋白OprM，故MexAB-OprM表達(dá)下調(diào)影響MexXY系統(tǒng)的表達(dá)水平，而MexABOprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN之間表達(dá)存在逆向關(guān)系，表明RND外排系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其嚴(yán)謹(jǐn)精密，各成員之間存在著極為復(fù)雜的相互關(guān)聯(lián)和作用[2]。

3 外排泵MexAB-OprM

3.1 外排泵 MexAB-OprM的作用機(jī)制 MexAB-OprM系統(tǒng)是RND家族藥物外排泵中發(fā)現(xiàn)最早、作用底物最廣泛的外排泵，其外排功能主要包括釋放抗生素以及一系列兩親分子、消毒劑、染料、溶劑或洗滌劑等外源性有毒化合物。MexAB-OprM系統(tǒng)在銅綠假單胞菌的獲得性耐藥中起主導(dǎo)作用，對(duì)多種抗生素如β-內(nèi)酰胺類、β-內(nèi)酰胺類抑制劑、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、替加環(huán)素類、新霉素類、巰基內(nèi)酰胺類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類等均具有外排作用[3，4]。有研究顯示，MexAB-OprM對(duì)氧氟沙星的外排是其導(dǎo)致銅綠假單胞菌多重耐藥的主要因素。同時(shí)，MexAB-OprM編碼基因呈組合性表達(dá)與銅綠假單胞菌的固有耐藥也密切相關(guān)。藥物試驗(yàn)證實(shí)MexAB-OprM的失活可使野生株P(guān)A對(duì)多種抗菌藥物高度敏感，證明了此系統(tǒng)在銅綠假單胞菌固有耐藥中的重要作用[5]。此外，研究表明，MexAB-OprM泵還作用于群體感應(yīng)系統(tǒng)（Quorumsensing system，QS系統(tǒng)），細(xì)菌利用QS在高細(xì)胞密度下通過(guò)產(chǎn)生稱為自身誘導(dǎo)物的信號(hào)分子來(lái)協(xié)調(diào)群體行為。銅綠假單胞菌有3個(gè)主要的相互連接的QS系統(tǒng)，即頂部的LAS系統(tǒng)、緊隨其后的RHLIR系統(tǒng)和假單胞菌喹諾酮信號(hào)分子（Pseudomonas quinolone signal，PQS）[6，7]。RHL系統(tǒng)產(chǎn)生的N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯（C4-HSL）信號(hào)自由擴(kuò)散到細(xì)胞外，而LAS和PQS分別產(chǎn)生的3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯（3-O-C12-HSL）和PQS信號(hào)需要由膜轉(zhuǎn)運(yùn)體穿過(guò)外膜輸出[8，9]。外排泵MexAB-OprM主要作用機(jī)制是運(yùn)輸LAS系統(tǒng)產(chǎn)生的QS前體信號(hào)分子3-O-C12-HSL，與3-O-C12-HSL的外流有關(guān)。更多的數(shù)據(jù)表明，外排泵MexAB-OprM也能外排參與細(xì)菌群體感應(yīng)的非滲透性自體誘導(dǎo)劑，其在內(nèi)源性金屬載體分泌中的額外功能提示外排泵MexAB-OprM可能間接參與重要小分子天然化合物的分泌[10]。

3.2 外排泵MexAB-OprM的基因調(diào)控機(jī)制 外排泵MexAB-OprM調(diào)控網(wǎng)絡(luò)涉及多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和調(diào)節(jié)因子，包括正向調(diào)控因子MexA、CpxR和ArmR和負(fù)向調(diào)控因子MexR、AmpR、NalC、NalD、MexT和MdrR1等[11]。MexA是MexAB-OprM外排泵的周質(zhì)輔助蛋白，MexA上調(diào)可以引起MexAB-OprM過(guò)表達(dá)，從而導(dǎo)致多藥耐藥[12]。MexR是一種由MexR基因編碼的局部抑制因子，位于MexAB-OprM操縱子的上游，MexR[13]突變通常與MexAB-OprM過(guò)表達(dá)相關(guān)。研究表明，MexR中由R70Q替換引起的MexAB-oprM的高表達(dá)是導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)氨曲南產(chǎn)生耐藥的重要因素[14]。NalC由PA3721基因編碼[15]，是TetR家族的抑制因子，負(fù)調(diào)控位于NalC下游的PA3720-PA3719操縱子。其中PA3719編碼一個(gè)僅包含53個(gè)氨基酸殘基調(diào)節(jié)因子為AmrR因子，其作為一種抗抑制因子與MexR相互作用，以變構(gòu)抑制MexR控制的基因表達(dá)。AmrR的失活可將MexAB-OprM的表達(dá)降低到野生型水平，從而使多重耐藥性銅綠假單胞菌恢復(fù)敏感性。同時(shí)，NalD調(diào)控因子的氨基酸突變也可導(dǎo)致MexAB-OprM藥物外排泵的過(guò)度表達(dá)[16]。此外，研究表明，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)RocS2-RocA2也可以通過(guò)RocA2響應(yīng)調(diào)節(jié)器抑制MexAB-OprM的表達(dá)。

4 外排泵MexXY-OprM

4.1 外排泵MexXY-OprM的作用機(jī)制 外排泵MexXY-OprM最主要的功能是通過(guò)主動(dòng)外排胞內(nèi)藥物而介導(dǎo)銅綠假單胞菌的天然和獲得性耐藥，可以外排氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、氯霉素、替加環(huán)素和兩性離子型頭孢菌素等抗菌藥物，從而誘導(dǎo)銅綠假單胞菌的耐藥。該外排泵具有底物特異性，其中氨基糖苷類是MexXY專一的特異底物。外排泵MexXY-OprM在銅綠假單胞菌野生型耐藥性表型中的作用僅限于針對(duì)核糖體的泵底物，例如核糖體靶位藥物四環(huán)素、慶大霉素、紅霉素等。與此同時(shí)在MexY周質(zhì)連接槽（Periplasm-linked cleft）也有其識(shí)別區(qū)，因此MexXY還可作為MexAB-OprM的補(bǔ)償機(jī)制協(xié)同外排氟喹諾酮類藥物，導(dǎo)致該類藥物耐藥水平升高。同時(shí)高氧環(huán)境亦可誘導(dǎo)MexXY表達(dá)上調(diào)，囊性纖維化患者分離菌株穩(wěn)定高表達(dá)MexXY，可能是細(xì)菌在局部活性氧富集環(huán)境下的應(yīng)激反應(yīng)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道MexXY-OprM也與PmrB突變體中的氨基糖苷類抗藥性有關(guān)，并通過(guò)ArmZ的抗阻遏蛋白的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制間接觸發(fā)操縱子MexXY的表達(dá)。編碼MexXY的TetR局部抑制子的基因MexZ的功能喪失突變是銅綠假單胞菌臨床菌株對(duì)氨基糖苷類藥物敏感性降低的常見原因。

4.2 外排泵MexXY-OprM的基因調(diào)控機(jī)制 MexXYOprM外排泵在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下可被核糖體靶向制劑誘導(dǎo)并產(chǎn)生耐藥性。氨基糖苷類修飾酶（AMES）的獲得是耐藥的主要驅(qū)動(dòng)因素。然而，AME的獲得與MexY的過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)[17]。MexXY-OprM是被描述為唯一外排氨基糖苷類藥物的泵。MexY是MexXY-OprM外排泵底物特異性的決定成分。在AME和氨基糖苷類存在的情況下，由于MexXY驅(qū)動(dòng)的外排活性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子水平增加，進(jìn)而影響耐藥性[17]。MexZ是MexY的負(fù)調(diào)控因子。MexXY操縱子被MexZ抑制，MexZ基因的產(chǎn)物與位于MexZ-MexX間隔區(qū)的反向重復(fù)區(qū)域結(jié)合，MexZ與MexZ-MexX基因間位點(diǎn)特異性結(jié)合，因此MexZ突變體可表現(xiàn)出組合性過(guò)表達(dá)MexXY-OprM[18]。同時(shí)MexXY可以對(duì)大環(huán)內(nèi)酯抗生素或肽脫甲化酰酶抑制劑進(jìn)行誘導(dǎo)。因此產(chǎn)生的異常多肽及其氧化修飾產(chǎn)物與PA5471相互作用，以此來(lái)調(diào)節(jié)MexXY。PA5471基因的破壞會(huì)損害藥物誘導(dǎo)的MexXY的表達(dá)，而PA5471本身同時(shí)由誘導(dǎo)MexXY表達(dá)的相同的核糖體靶向藥物進(jìn)行誘導(dǎo)。體外條件下，外排泵通常在基礎(chǔ)水平表達(dá)，調(diào)節(jié)子和/或抑制子的突變導(dǎo)致這些元件的過(guò)度表達(dá)，在MDR表型的獲得和表達(dá)中起主要作用[19]。突變的調(diào)節(jié)子主要包括AcrA和AcrB，AcrA蛋白的作用主要是促進(jìn)外排體系與細(xì)胞膜的融合，同時(shí)含有醛基的化合物（如肉桂醛和檸檬醛）在銅綠假單胞菌中誘導(dǎo)親電應(yīng)激反應(yīng)，刺激MexXY-OprM主動(dòng)外排，增加了細(xì)菌對(duì)泵底物抗生素的耐藥性[20]。

5 外排泵MexCD-OprJ

5.1 外排泵MexCD-OprJ的作用機(jī)制 MexCD-OprJ外排泵臨床上并不常見，由于編碼MexCD-OprJ的操縱子在常規(guī)生長(zhǎng)條件下表達(dá)水平非常低，主要參與銅綠假單胞菌的獲得性耐藥。有研究報(bào)道，由于PQS系統(tǒng)的前體4-羥基-2-庚基喹啉（4-hydroxy-2-heptylquinoline，HHQ）被MexCD-OprJ從菌體內(nèi)排出，減少其在細(xì)菌內(nèi)的積累，從而影響銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)反應(yīng)，這表明PQS也可能是MexCDOprJ的底物[21]。研究表明，MexCD-OprJ外排泵的過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢吡肟和氯霉素的耐藥性增加，但同時(shí)由于MexCDOprJ外排泵對(duì)MexXY-OprM外排作用有一定影響，導(dǎo)致MexCD-OprJ外排泵對(duì)氨曲南、亞胺培南、氨芐西林和氨基糖苷類敏感性更高[22]。此外，MexD底物特異性的修飾可以誘導(dǎo)MexCD-OprJ的過(guò)度表達(dá)，從而損害AMpC和β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)性表達(dá)。

5.2 外排泵MexCD-OprJ的基因調(diào)控機(jī)制 MexCDOprJ外排泵的調(diào)控主要由于外排泵膜蛋白MexC、MexD和OprJ表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)。消毒劑和染料可以誘導(dǎo)NfxB基因的突變，該基因?yàn)镸exCD-OprJ外排泵的啟動(dòng)子，從而導(dǎo)致MexCDOprJ的表達(dá)急劇增加，但這種效應(yīng)不能由普通抗生素誘導(dǎo)產(chǎn)生[23]。殺菌劑、陽(yáng)離子抗菌肽、洗滌劑等通過(guò)釋放膜脂成分來(lái)破壞OM和/或IM，使IM相關(guān)的Muc蛋白發(fā)出信號(hào)，使依賴AlgU的Muc-AlgU復(fù)合物極不穩(wěn)定[24]。因此，AlgU變得活躍，并正向調(diào)控MexCD-OprJ的表達(dá)。此外，MexCD-OprJ的生理功能可能是從受損的細(xì)胞膜中排出相關(guān)成分。最新研究顯示，NfxB突變體中有7 bp缺失而新產(chǎn)生的nt213Δ7突變體，會(huì)引起銅綠假單胞菌對(duì)新型頭孢菌素-β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合的耐藥性[25]。同時(shí)相關(guān)研究表明，MexCD-OprJ外排泵可以通過(guò)Gyr突變（主要為Gyrb突變）引起表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致氟喹諾酮類抗生素耐藥性提高[26]。

6 外排泵MexEF-OprN

6.1 外排泵MexEF-OprN的作用機(jī)制 MexEF-OprN外排泵可以外排環(huán)丙沙星、氯霉素和甲氧芐啶等藥物，但通常對(duì)環(huán)丙沙星顯示出低水平耐藥。主要在NfxC突變體中出現(xiàn)調(diào)控基因的突變引起表達(dá)上調(diào)。研究表明，MexEF-OprN外排泵的過(guò)表達(dá)可以短暫提高銅綠假單胞菌抗生素耐藥性，導(dǎo)致該菌從抗生素暴露中存活下來(lái)從而誘發(fā)感染[27]。對(duì)于囊性纖維化患者，MexEF-OprN外排泵過(guò)度表達(dá)可以降低相關(guān)毒力因子（鼠李糖脂、彈性蛋白酶和綠膿素等）的表達(dá)，從而降低炎癥反應(yīng)，更好地促進(jìn)銅綠假單胞菌的定植，使治療變得困難[28]。此外，MexEF-OprN外排泵可以誘導(dǎo)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中的RHL系統(tǒng)表達(dá)，其調(diào)控因子MexT也可影響細(xì)菌的生長(zhǎng)[29]。

6.2 MexEF-OprN外排泵的基因調(diào)控機(jī)制 MexEFOprN外排泵有兩種獨(dú)立的調(diào)控途徑，即MexS介導(dǎo)的通路和非MexS單獨(dú)介導(dǎo)的通路。MexS介導(dǎo)的MexEF-OprN的復(fù)雜調(diào)控在不同銅綠假單胞菌菌株間具有差異性。其中，MexS的單點(diǎn)突變可以導(dǎo)致MexS活性部分或完全缺失，并導(dǎo)致銅綠假單胞菌MexEF-OprN的顯著上調(diào)[30]。非MexS單獨(dú)介導(dǎo)的通路是指MexT和MexS基因的活性影響相關(guān)底物的活性，MexT是一種LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，位于MexEF-OprN操縱子上游，而MexS基因位于MexT上游[31]。研究表明，MexT寡聚體上第257位氨基酸的取代引起的結(jié)構(gòu)變化可能會(huì)影響MexEFOprN外排泵的表達(dá)[32]。此外，GyrA中D87G突變與MexS中F7S突變引起的MexEF-OprN高表達(dá)是促使銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的主要因素。GyrA的D87G突變使環(huán)丙沙星的MIC增加了4倍，而MexS中F7S突變引起的MexEF-OprN高表達(dá)使環(huán)丙沙星的MIC增加了8倍。同時(shí)研究表明，全局調(diào)控因子MvaT獨(dú)立于MexT和MexS負(fù)調(diào)控MexEF-OprN的表達(dá)。當(dāng)MvaT缺失和MexEFOprN過(guò)表達(dá)后，對(duì)氯霉素和諾氟沙星的耐藥性增加，但對(duì)亞胺培南的敏感性增強(qiáng)[30，33]。

7 結(jié)語(yǔ)

由于多重耐藥銅綠假單胞菌數(shù)量的日益增長(zhǎng)，使得攻克多重耐藥銅綠假單胞菌越發(fā)重要，主動(dòng)外排機(jī)制是導(dǎo)致多重耐藥銅綠假單胞菌的重要因素。RND外排泵在主動(dòng)外排機(jī)制中至關(guān)重要，由于其參與調(diào)節(jié)群體感應(yīng)、影響毒力因子表達(dá)、生物膜形成、細(xì)菌耐藥基因突變及逆轉(zhuǎn)、細(xì)菌瞬時(shí)和持久耐藥性等。因此抑制其表達(dá)可恢復(fù)多重耐藥銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物敏感性。而外排泵抑制劑主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)、干擾外排泵相關(guān)蛋白進(jìn)行組合、阻斷供能效應(yīng)、抑制底物通過(guò)外排泵通道等機(jī)制下調(diào)其表達(dá)，從而抑制主動(dòng)外排。因此研究外排泵系統(tǒng)的作用機(jī)制和基因調(diào)節(jié)，通過(guò)抑制外排泵的表達(dá)，可以對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌提供有效的治療手段。