江清梅 任宇航 朱曉峰 尹昌浩

隨著人口老齡化進(jìn)程的日益加快，老年病逐漸增加，其中以癡呆最為常見[1]。癡呆作為世界范圍內(nèi)備受關(guān)注的社會問題，其病因研究逐漸深入。在注重飲食健康的現(xiàn)代社會中，高脂飲食及酒精依賴對認(rèn)知障礙的影響越來越受到重視。流行病學(xué)研究表明，高脂飲食及酒精依賴與癡呆相關(guān)，酒精通過影響海馬回路損害空間學(xué)習(xí)記憶能力[2]。研究還表明，高脂飲食及酒精依賴導(dǎo)致癡呆的病理學(xué)改變，包括大腦中的β-淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)炎斑塊形成，并加重學(xué)習(xí)和記憶障礙[3]。盡管高脂飲食和酒精依賴對海馬神經(jīng)元損傷已被證實(shí)存在，但其分子機(jī)制尚不清楚。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β） 有3種亞型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3），是一個由約100種不同蛋白質(zhì)組成的大型多效性超家族，參與發(fā)育、疾病和組織修復(fù)關(guān)鍵步驟的調(diào)節(jié)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中，TGF-β/Smad信號通路由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生，并參與基本的組織功能。有動物研究證明，在海馬、齒狀回和扣帶回皮層中觀察到特別強(qiáng)的Smad3 mRNA、Smad4 mRNA的原位雜交信號[4]。最近研究表明，癡呆患者大腦中TGF-β1含量異常增加，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子、趨化因子和自由基可能會促進(jìn)炎癥、氧化狀態(tài)和TGF-β1慢性過度分泌，從而促進(jìn)微血管變性[5]。TGF-β/Smad作為促炎因子相關(guān)通路，對神經(jīng)退行性疾病有明顯影響，因此，高脂飲食和酒精依賴相關(guān)認(rèn)知障礙可能與海馬內(nèi)TGF-β/Smad通路所致炎癥發(fā)生有關(guān)。本研究主要探討高脂飲食及酒精依賴對雄性SD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，同時檢測海馬中TGF-β1、P-Smad3和Smad4表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 動物分組及造模 8周齡（200±20）g雄性SD大鼠20只，由牡丹江醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物許可證號為SYXK（黑）2019-006，室溫（20±2）℃，光照/黑暗比例12h:12h。經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)區(qū)組法將大鼠分為對照組（n=4）、酒精組（n=8）、酒精+高脂飲食組（n=8）。對照組、酒精組給予正常飼料，酒精+高脂飲食組給予高脂高糖飲食；各組均采用單瓶自由飲方式攝入液體，對照組飲用無菌水，酒精組、酒精+高脂飲食組第1周飲用3%的酒精，之后逐漸增加酒精濃度，即每周增加3%，直至第4周增加至12%[6]。

1.2 主要試劑及儀器 高脂高糖飼料（小黍有泰生物科技有限公司，北京），伊紅染色液（索萊寶G1100），蘇木素染色液（索萊寶G1140），β-Actin（Cell Signaling 8457T），P-Smad3一抗（Cell Signaling 9520），Smad4一抗（Cell Signaling 46535），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（碧云天A0208）。Morris水迷宮（成都泰盟軟件有限公司），正置顯微鏡（德國徠卡公司），超靈敏多功能成像儀（美國GE公司）。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 造模28d后，各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮（直徑120cm，高50cm，成都泰盟軟件有限公司）實(shí)驗(yàn)。水箱通過成像線分成4個象限，將平臺（直徑15cm）置于第一象限水位下方1cm處（不可見），限時60s，規(guī)定大鼠進(jìn)水至站立平臺的時間為潛伏期，對大鼠運(yùn)動軌跡錄像；若超出60s仍未站立平臺，則人工引導(dǎo)并停留15～30s。整個實(shí)驗(yàn)共7天，每天重復(fù)2遍，最后一天撤除平臺，對大鼠到原平臺區(qū)域的潛伏期及次數(shù)做記錄。

1.4 顯微鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu) 所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g）進(jìn)行麻醉，斷頭解剖海馬，每組取2只大鼠的海馬組織由4%多聚甲醛進(jìn)行固定，其余海馬組織-80℃冰箱進(jìn)行保存，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。多聚甲醛固定72h后經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、烘片后進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下拍照記錄各組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。

1.5 ELISA試劑盒檢測各組大鼠海馬中TGF-β1含量 從-80℃冰箱取出各組海馬組織，由預(yù)冷的PBS清洗，稱取15mg，按照1:9的重量體積比量取含有蛋白酶抑制劑的PBS，于冰上充分研磨，4℃下12 000r/min離心15min，取上清，在TGF-β1包被的微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過37℃溫育及洗板、顯色，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-blot）檢測海馬中P-Smad3、Smad4的表達(dá) 用預(yù)冷的PBS清洗各組海馬組織20mg，按照1：10的比例加入含有蛋白酶、磷酸酶抑制劑的裂解液，充分研磨、離心、取上清，各組完成提取蛋白后，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉1h，用P-Smad3一抗（1:1000）、Smad4一抗（1:1000）和抗β-actin抗體（1:1000）孵育過夜。洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1:1000）孵育1h，洗膜后涂加顯色劑、曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖像分析測量軟件為Image J，數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（±S.E.M.）。多組比較采用單因素方差分析（ANOVA）后進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 酒精及高脂飲食對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 造模28d后，測試3組大鼠記憶能力，定位航行訓(xùn)練中，3組大鼠的潛伏期逐漸縮短，但是與對照組相比，2個模型組的潛伏期均延長，且在第6天時差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。通過監(jiān)視系統(tǒng)的大鼠運(yùn)動軌跡來看，在經(jīng)過6天訓(xùn)練期后，對照組大鼠運(yùn)動軌跡平短，趨向性強(qiáng)，很快找到平臺；酒精組大鼠較對照組大鼠趨向性差，需要較長時間才能找到平臺，說明記憶力有損；酒精+高脂飲食組大鼠運(yùn)動軌跡復(fù)雜、混亂，趨向性最差，多成邊緣化運(yùn)動軌跡，見圖1?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，對照組經(jīng)過原平臺位置次數(shù)為（6.00±0.91）次，酒精組為（4.25±0.53）次，酒精+高脂飲食組為（3.60±0.46）次，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明酒精組、酒精+高脂飲食組大鼠記憶力嚴(yán)重受損。

表1 各組大鼠定位航行訓(xùn)練潛伏期（s）

圖1 各組大鼠定位航行訓(xùn)練運(yùn)動軌跡比較

2.2 顯微鏡觀察大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu) HE染色觀察各組海馬CA1區(qū)結(jié)果顯示，對照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核圓且大，錐體細(xì)胞帶致密、整齊、均勻；酒精組海馬錐體細(xì)胞帶開始有細(xì)胞脫落，排列較松散，部分胞質(zhì)深染；酒精+高脂飲食組海馬神經(jīng)元減少且形態(tài)異常，錐體細(xì)胞帶排列松散且分布紊亂，胞質(zhì)深染，見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色（×200）

2.3 酒精及高脂飲食對大鼠海馬TGF-β1水平的影響 TGF-β1在各組大鼠海馬表達(dá)水平分別為對照組（2293.38±132.36）pg/ml、酒精組（2444.81±99.99）pg/ml、酒精+高脂飲食組（2690.02±81.16）pg/ml，與對照組相比，酒精+高脂飲食組TGF-β1水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023）。

2.4 酒精及高脂飲食對大鼠海馬P-Smad3、Smad4水平的影響 對照組、酒精組、酒精+高脂飲食組大鼠P-Smad3、Smad4表達(dá)逐漸增加，與對照組相比，酒精組、酒精+高脂飲食組大鼠P-Smad3、Smad4表達(dá)水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 Western-blot檢測各組大鼠海馬組織P-Smad3、Smad4蛋白相對表達(dá)量（±S.E.M.）

表2 Western-blot檢測各組大鼠海馬組織P-Smad3、Smad4蛋白相對表達(dá)量（±S.E.M.）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別 P-Smad3/β-actin Smad4/β-actin對照組 1.30±0.06 0.82±0.01酒精組 1.91±0.23* 1.36±0.71*酒精+高脂飲食組 2.46±0.15* 1.88±0.18*

3 討論

在長期高脂飲食及酒精依賴的條件下，發(fā)生中樞神經(jīng)元損傷及認(rèn)知障礙已有報道。一項(xiàng)對來自14個不同研究的1 394例輕度認(rèn)知障礙受試者的研究顯示，其危險因素包括抑郁癥、肥胖和高膽固醇血癥等，酒精依賴尤為顯著地增加了認(rèn)知能力下降的風(fēng)險[7]。與既往研究結(jié)果一致，在本次Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，酒精組、酒精+高脂飲食組大鼠潛伏期均長于對照組，觀察大鼠的運(yùn)動軌跡可知，酒精組及酒精+高脂飲食組大鼠因記憶力受損，運(yùn)動軌跡復(fù)雜、混亂，趨向性差，導(dǎo)致遲遲找不到平臺，說明酒精及高脂飲食對大鼠的空間記憶能力、學(xué)習(xí)能力均產(chǎn)生了不利影響。

海馬是與認(rèn)知相關(guān)的重要腦區(qū)之一。一項(xiàng)關(guān)于癡呆患者危險因素與腦區(qū)結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，酒精依賴與海馬區(qū)灰質(zhì)體積減少獨(dú)立相關(guān)[8]，海馬神經(jīng)發(fā)生減少，嚴(yán)重影響認(rèn)知能力。動物研究表明，喂食高脂飲食的嚙齒類動物在體重增加之前的3～5天內(nèi)，表現(xiàn)出海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶能力受損[9]。目前公認(rèn)的是神經(jīng)發(fā)生經(jīng)歷了復(fù)雜的步驟，對大腦的動態(tài)平衡起著重要作用，同樣在海馬區(qū)中的干細(xì)胞需經(jīng)歷復(fù)雜過程分化為新的神經(jīng)元細(xì)胞及其他腦細(xì)胞，為保持大腦認(rèn)知功能起著關(guān)鍵作用，但是該過程要面臨許多內(nèi)在及外在因素的干擾，已證實(shí)高脂飲食及酒精攝入對神經(jīng)發(fā)生具有顯著的危害作用。一項(xiàng)薈萃分析集中觀察了41項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)高脂飲食增加海馬炎癥和海馬神經(jīng)發(fā)生減少，使個體面臨更高的輕度認(rèn)知損害風(fēng)險，并且加速認(rèn)知障礙疾病進(jìn)程[10]。本研究中對照組海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密，酒精組和酒精+高脂飲食組海馬神經(jīng)元細(xì)胞均有不同程度的減少，且排列不規(guī)則、核質(zhì)深染，表明隨著酒精、高脂飲食的長期攝入，會造成海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究主要經(jīng)HE染色觀察酒精、高脂飲食對海馬組織切片的變化，也可通過凋亡染色完成對海馬組織凋亡情況的進(jìn)一步研究。

目前，對于高脂飲食及酒精依賴造成認(rèn)知障礙的機(jī)制研究較多，近年來多種研究表明，炎癥反應(yīng)在認(rèn)知障礙的神經(jīng)元損傷機(jī)制中作用比較突出。長期飲酒及高脂飲食會提高中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的酒精濃度、膽固醇水平，破壞血腦屏障，導(dǎo)致海馬炎癥因子表達(dá)增加，影響學(xué)習(xí)及記憶功能[11]。TGF-β是一種多效性細(xì)胞因子，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥和損傷后修復(fù)中起關(guān)鍵作用。大腦中的TGF-β在正常機(jī)體中具有抗炎作用，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。然而，TGF-β過度表達(dá)促進(jìn)大腦炎癥，同時促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦微血管周圍聚集，加速腦血管β-淀粉樣蛋白沉積，降低腦實(shí)質(zhì)Aβ病理改變的同時，可引起相關(guān)區(qū)域血流灌注損傷，并誘導(dǎo)神經(jīng)元Aβ分泌[12]。TGF-β/Smad信號通路被認(rèn)為涉及多種生理和病理機(jī)制，這些機(jī)制與多種神經(jīng)疾病有關(guān)，包括帕金森病、多發(fā)性硬化癥和阿爾茲海默癥，所以TGF-β/Smad通路與認(rèn)知障礙相關(guān)疾病密切相關(guān)。機(jī)體遭受有害因素刺激或細(xì)胞外基質(zhì)異動時，如酒精及高脂飲食，TGF-β明顯活化，細(xì)胞表面TGF-β家族受體的功能復(fù)合物包括TGF-βI型（TGF-βRI）受體、TGF-βⅡ型（TGF-βRⅡ）受體、激活素受體樣激酶5（ALK5），因此激活的TGF-βRⅠ磷酸化選定的Smad變成P-Smad2、P-Smad3，這些受體激活的Smad與Smad4形成復(fù)合體，易位到細(xì)胞核中，進(jìn)一步調(diào)節(jié)涉及細(xì)胞增殖的各種靶基因的表達(dá)。在一項(xiàng)關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞與阿爾茲海默癥的病理機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白前體變性與TGF-β/Smad信號激活有關(guān)，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、淀粉樣斑塊形成和認(rèn)知障礙加重，表明TGF-β/Smad通路信號激活與認(rèn)知功能損害和淀粉樣斑塊積聚有必然聯(lián)系[13]。本研究中酒精組、酒精+高脂飲食組大鼠海馬中TGF-β1、P-Smad3、Smad4表達(dá)增加，且與對照組相比，酒精組、酒精+高脂飲食組P-Smad3、Smad4表達(dá)顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明酒精、高脂飲食對機(jī)體的損傷激活了TGF-β/Smad信號通路。

本研究給予大鼠酒精、酒精+高脂飲食喂養(yǎng)28d后，觀察大鼠認(rèn)知行為的改變及海馬神經(jīng)元變化，發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)炎癥因子TGF-β1、P-Smad3、Smad4表達(dá)增加，學(xué)習(xí)記憶能力下降，可能與TGF-β/Smad通路激活造成大腦中β-淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)炎性斑塊聚集有關(guān)。抑制外周及中樞神經(jīng)組織中TGF-β/Smad通路相關(guān)異常因子可能是治療癡呆的一種較好方法。