高子晴 崔彤霞

Klotho是近年發(fā)現(xiàn)的一種與衰老相關(guān)的蛋白，其主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，不同原因引起的慢性腎臟病（Chronic kidney disease，CKD）均可導(dǎo)致Klotho表達(dá)下調(diào)，Klotho缺乏是CKD的早期表現(xiàn)，同時(shí)也加速CKD的進(jìn)展[1]?，F(xiàn)已證實(shí)甲狀旁腺激素（Parathyroid hormone，PTH）是慢性腎臟病患者體內(nèi)的重要毒素之一，可引起軟組織及心血管鈣化等全身多系統(tǒng)損害，而Klotho可抑制AngⅡ的激活，減緩CKD的進(jìn)程[2]，并可以增加血磷的排泄，進(jìn)一步減少PTH的生成[3，4]。Strutz等[5]首次提出腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腎臟纖維化的重要因素之一，標(biāo)志著CKD的結(jié)局，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中失去上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如E-cadherin），獲得間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如α-SMA）的高表達(dá)。近年研究證實(shí)，Rho/Rock信號(hào)通路是導(dǎo)致CKD腎臟纖維化的重要信號(hào)通路之一[6]。法舒地爾（Fasudil）是體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)使用最為普遍的Rho/Rock信號(hào)通路抑制劑，為研究用法舒地爾抑制或減輕PTH誘導(dǎo)的CKD提供了理論依據(jù)[7]，但是否可以通過(guò)提高Klotho的表達(dá)來(lái)減輕PTH引起的EMT尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬觀察不同濃度法舒地爾對(duì)PTH誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞EMT中Klotho表達(dá)的影響，以探討Klotho及法舒地爾在慢性腎臟病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2（美國(guó)ATCC，CRL-2190TM）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素（美國(guó)Gibco）；上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（美國(guó)Peprotech）；法舒地爾注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格30mg/2ml）；PTH 1-34（美國(guó)Sigma）；α-SMA抗體、E-cadherin抗體、Klotho抗體（美國(guó)Santa），PBS溶液（美國(guó)Gibco），定量PCR試劑盒（瑞士Roche），Total RNA提取試劑（美國(guó)Invitrogen Life Technologies），BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Bio-rad）；Actin（美國(guó)CST）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 原代腎小管上皮細(xì)胞在上皮細(xì)胞培養(yǎng)基（胎牛血清10ml，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子1ml，青霉素/鏈霉素1ml，加入88ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中）培養(yǎng)下傳代，取第3代上皮細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為：空白對(duì)照組（C組）：腎小管上皮細(xì)胞不作任何處理；T1組：PTH（10-10mol/L）+法舒地爾（0μmol/L）；T2組：PTH（10-10mol/L）+法舒地爾（10μmol/L）；T3組：PTH（10-10mol/L）+法舒地爾（20μmol/L）；T4組：PTH（10-10mol/L）+法舒地爾（30μmol/L）。培養(yǎng)時(shí)間為48h。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Western-blot檢測(cè)Klotho蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)48h后，用TBS緩沖鹽水沖洗腎小管上皮細(xì)胞3次，在培養(yǎng)皿中加入RIPA裂解緩沖液，通過(guò)反復(fù)搖動(dòng)使試劑與細(xì)胞充分混合，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下來(lái)并收集。細(xì)胞裂解液（30μg）在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，與驢抗鼠抗體（0.2μg/ml）、驢抗兔抗體（0.2μg/ml）作為內(nèi)部對(duì)照進(jìn)行雜交，然后用1μg/ml抗驢免疫球蛋白G-過(guò)氧化物結(jié)合物對(duì)條帶進(jìn)行掃描測(cè)量其強(qiáng)度，使用數(shù)字凝膠電泳圖像處理和分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)E-cadherin、α-SMA及Klotho mRNA表達(dá) 培養(yǎng)48h后，用Trizol試劑從腎小管上皮細(xì)胞分離出總RNA。進(jìn)行RT-PCR分析，用反轉(zhuǎn)錄酶和oligo dT引物從1μg總RNA中合成cDNA，體積為10μl，用Tris/EDTA緩沖液將反應(yīng)混合物調(diào)整為50μl，用于PCR分析。cDNA擴(kuò)增反應(yīng)混合物最初在95℃溫育30s以使DNA變性；擴(kuò)增進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95℃5s，60℃34s。RTPCR在以下條件下進(jìn)行，95℃2min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95℃35s，60℃1min，72℃2min，通過(guò)熔解曲線分析，用肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)源性控制基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行處理。使用引物：E-cadherin：上游5'-CCGGGACAACGTTTATTACTAT-3'，下游5'-CATA GTCAAACACGAGCAGAGAAT-3'；α-SMA：上游5'-CTTGAGAAGAGTTACGAGTTGC-3'，下 游5'-GATGCT GTTGTAGGTGGTTTC-3'；Klotho：上游5'-ACAATACT TCTTTCCGTCCCACT-3'，下游5'-GAGCAAAAAAGTC AGCAGTTCCT-3'；Actin：上游5'-CACCCAGCACAAT GAAGATCAAGAT-3'，下游5'-CCAGTTTTTAAATCCT GAGTCAAGC-3'。根據(jù)2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩之間比較采用LST-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 倒置顯微鏡下觀察，正常腎小管上皮細(xì)胞呈圓形或類圓形，排列如鋪路石樣，經(jīng)PTH刺激后不同程度地拉長(zhǎng)，變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或不規(guī)則形，胞間連接變松散，排列呈索條狀。外源性給予法舒地爾后，上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的細(xì)胞數(shù)量減少，見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

2.2 Western-blot檢測(cè)結(jié)果 T1組在PTH的刺激下Klotho蛋白表達(dá)明顯減少；而在法舒地爾干預(yù)下，T2～T4組Klotho蛋白表達(dá)明顯增多，并且隨著法舒地爾的濃度增高，Klotho蛋白水平逐漸升高，T3組達(dá)到峰值，T4組與T3組相比稍有下降，見(jiàn)圖2。

圖2 各組Klotho蛋白的表達(dá)

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 T1組在PTH刺激下Klotho mRNA表達(dá)明顯減少。而在法舒地爾的干預(yù)下，與T1組相比T2～T4組Klotho mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05），并且隨著法舒地爾的濃度增高，Klotho mRNA表達(dá)水平逐漸升高，T3組達(dá)到峰值，T4組稍有下降，但與T3組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與C組相比，T1～T4組E-cadhernin mRNA表達(dá)明顯下降，α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加，尤其以T1組最為顯著（P<0.05）。在T1～T3組，隨著法舒地爾濃度增高，E-cadhernin mRNA表達(dá)量逐漸上升，α-SMA mRNA表達(dá)量逐漸下降，T3組達(dá)到峰值，T4組稍有所下降，但T3、T4組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），各組與T1組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組E-cadherin、α-SMA、Klotho mRNA水平比較（±s）

表1 各組E-cadherin、α-SMA、Klotho mRNA水平比較（±s）

注：與T1組比較，*P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05

項(xiàng)目 C 組 T1組 T2組 T3組 T4組α-SMA mRNA 0.901±0.015* 2.278±0.116Δ 1.811±0.364*Δ 1.300±0.083*Δ 1.402±0.127*Δ E-cadherin mRNA 1.493±0.011* 0.295±0.007Δ 0.824±0.032*Δ 1.186±0.097*Δ 1.092±0.027*Δ Klotho mRNA 1.207±0.029* 0.362±0.016Δ 0.882±0.101*Δ 1.291±0.091*Δ 1.212±0.038*Δ

3 討論

腎小管EMT是腎臟成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源，在腎臟纖維化的發(fā)生與進(jìn)展中起著重要作用，其中PTH是促進(jìn)EMT的重要細(xì)胞因子。Klotho蛋白是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種與衰老相關(guān)的蛋白，其主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)。有研究表明，在腎臟損傷情況下，Klotho蛋白表達(dá)下調(diào)，而該蛋白表達(dá)下調(diào)促進(jìn)了腎臟損傷，導(dǎo)致Klotho蛋白進(jìn)一步下降，通過(guò)提高內(nèi)源性Klotho蛋白表達(dá)或增加外源性Klotho蛋白可緩解及阻止腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，說(shuō)明Klotho蛋白不僅是早期腎損傷的標(biāo)記物，更是保護(hù)因子[8，9]。法舒地爾是唯一用于臨床的Rho/Rock信號(hào)通路選擇性抑制劑[10]，可以減少蛋白尿和腎小球系膜外基質(zhì)堆積，減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化等[11～13]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)研究Rho/Rock信號(hào)通路抑制劑法舒地爾對(duì)PTH誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞EMT中Klotho蛋白表達(dá)的影響，可能有助于尋找防治腎臟纖維化的新靶點(diǎn)。

本研究在倒置顯微鏡下觀察正常腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)，呈圓形或類圓形，排列如鋪路石樣，不雜亂；而加入PTH后，腎小管上皮細(xì)胞呈不同程度的拉長(zhǎng)，變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或不規(guī)則形，胞間連接變松散，排列呈索條狀，呈典型的纖維樣改變。在法舒地爾的干預(yù)下，發(fā)生形態(tài)改變的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，EMT明顯減輕。說(shuō)明PTH可以誘導(dǎo)EMT，而外源性給予法舒地爾可明顯減輕纖維化程度，減少腎小管上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步延緩CKD進(jìn)程。

通過(guò)Western-blot和RT-PCR檢測(cè)Klotho蛋白和mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，T1組在PTH刺激下Klotho mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少，而在法舒地爾的干預(yù)下，T2～T4組Klotho mRNA和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，并且隨著法舒地爾的濃度增高，Klotho mRNA和蛋白水平逐漸升高，其中法舒地爾在20μmol/L時(shí)作用最顯著，并且T3、T4組Klotho mRNA表達(dá)水平均高于C組，說(shuō)明在PTH誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)源性Klotho表達(dá)明顯減少，而在Rho/Rock信號(hào)通路抑制劑法舒地爾的干預(yù)下，腎小管上皮細(xì)胞EMT程度減輕，并可同時(shí)誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)源性Klotho表達(dá)增高，更進(jìn)一步減輕EMT。隨著Klotho的表達(dá)增加，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)下調(diào)，標(biāo)志著EMT程度減輕，也從另一個(gè)角度說(shuō)明在法舒地爾的干預(yù)下，上調(diào)Klotho的表達(dá)可減緩EMT的發(fā)生、發(fā)展。提示Klotho在腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的保護(hù)作用。但是關(guān)于Klotho的傳導(dǎo)通路、對(duì)腎臟的具體保護(hù)作用機(jī)制及PTH、Rho/Rock信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT的機(jī)制等尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，法舒地爾在PTH誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞EMT中，可能通過(guò)上調(diào)Klotho表達(dá)減緩EMT的發(fā)展。