劉育辰， 王文全*， 郭洪祝

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京100102;2.北京市藥品檢驗所，北京100035)

甘草為豆科(Zeguminosae)植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)和光果甘草(Glycyrrhia glabra L.)的根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，傳統(tǒng)中醫(yī)藥認為它具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和藥性的功效［1］。

甘草中的化學成分比較復雜，主要有三萜皂苷類化合物(甘草酸、甘草次酸)、黃酮類化合物(甘草苷、異甘草苷)及甘草多糖等。現(xiàn)代藥理學實驗表明黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌抗病毒等作用;甘草酸具有保肝和治肝、治療腎病和心臟疾病、抗病毒、抗菌等作用;甘草多糖具有抗病毒、抗腫瘤、提高免疫功能［2］。隨著對甘草化學成分研究的不斷深入，如何將有限的甘草資源分離純化成更多、更純的甘草有效成分具有廣泛的經(jīng)濟效益和社會效益，受到越來越多國內(nèi)外學者的關(guān)注，甘草有效成分的提取、純化工藝已成為近年來的一個研究熱點。目前甘草有效成分提取、純化方法很多，本文將有關(guān)其提取、純化甘草有效成分的方法做一概述，為進一步研究甘草有效成分的提取、純化工藝提供參考。

1 提取方法

1.1 溶劑法

1.1.1 水提法

水提取法是最原始，也是過去常用的提取甘草有效成分的一種方法，此法雖然對提取設(shè)備要求簡單［3］、操作簡便，但提取得率較低［4］，并且提取液存放易腐敗變質(zhì)，后續(xù)的過濾等操作困難、費時，原因可能是由于極性大的水作溶劑，易把蛋白質(zhì)、糖類等易溶于水的成分浸提出來，因此也易霉變［5］。但如果需要提取多糖、苷類等極性大的成分時，因為此法溶劑價格低廉，仍為一種可取的提取方法。劉曄瑋等［6］采用正交試驗確定水提取甘草多糖的最佳工藝，浸膏得率為4.35%，多糖質(zhì)量分數(shù)為45.03%，說明工藝可行，為甘草活性多糖的開發(fā)研究提供依據(jù)。

1.1.2 有機溶劑提取法

有機溶劑提取法是提取甘草有效成分最常用的方法，由于其生產(chǎn)成本較低，設(shè)備簡單，在工業(yè)中得到廣泛應用［7］。該方法工藝簡單，收率高，同時可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但容易造成環(huán)境污染以及產(chǎn)品中的有機溶劑殘留，影響產(chǎn)品質(zhì)量。由于甘草的主要成分是黃酮類和三萜皂苷類，因此廣泛用于提取甘草的有機溶劑主要有甲醇、乙醇、丙酮和氯仿。此外，也有采用稀氨水［8，9］或氨性乙醇提?。?0，11］的報道。甘草有效成分的提取常采用浸漬法、滲漉法和回流提取法。車慶明［12］加乙醇、丙酮、氯仿等有機溶劑，采用浸泡的提取方法從甘草或甘草廢渣中提取甘草黃酮。

1.2 超聲提取法

超聲提取法是利用超聲波的空化作用、機械作用、熱效應等以增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而提高目標成分浸出率的方法，它具有省時、節(jié)能、提取效率高等優(yōu)點，是一種快速、高效的提取新方法，且提取中無加熱過程，可避免加熱因素引起的藥物成分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，能用于熱敏性成分的提取［13］，目前適用于工業(yè)化生產(chǎn)的超聲提取設(shè)備已經(jīng)研制成功［14］，為這一技術(shù)的實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。利用超聲法可以提取甘草中的多種成分，如:甘草酸、甘草黃酮和甘草多糖等。

1.2.1 超聲法提取甘草酸

李劍君等［15］在傳統(tǒng)的正交試驗方法的基礎(chǔ)上，用人工神經(jīng)網(wǎng)絡方法進行優(yōu)化，獲得了超聲提取甘草酸的優(yōu)化工藝條件，得到的粗品提取率為23.56%，該優(yōu)化工藝條件可降低工藝成本及能耗，具有更好的可操作性。

謝果等［16］也優(yōu)選了超聲法提取甘草酸的工藝參數(shù)，與傳統(tǒng)提取法相比，150 min甘草酸的提取率可達87.4%，體現(xiàn)了超聲提取法的耗時少，提取率高的優(yōu)勢。

崔永明等［17］對甘草酸的各種提取方法進行了對比研究。結(jié)果表明，超聲提取與傳統(tǒng)攪拌提取、酶解提取及反復凍溶提取相比，是較適于從甘草中快速高效提取甘草酸的新方法。

1.2.2 超聲法提取甘草黃酮

曾超珍等［18］采用超聲波法通過正交試驗提取甘草中的黃酮，黃酮提取率為6.23%。

付玉杰等［19］采用超聲法提取烏拉爾甘草中異甘草素，異甘草素的提取率為0.37‰，是乙醇熱回流提取的2.06倍，是索氏提取的1.54倍。超聲提取浸膏中異甘草素的質(zhì)量分數(shù)為0.55%，是乙醇熱回流提取的3.24倍，是索氏提取的1.45倍。表明超聲提取能顯著加速植物中的有效成分浸出，且提取率高，有效成分質(zhì)量分數(shù)高。

1.2.3 超聲法提取甘草多糖

趙春建等［20］優(yōu)選的提取甘草多糖的工藝，得到甘草多糖的平均提取率為5.40%，純度為39.95%。李炳奇等［21］從甘草渣中超聲提取甘草多糖和甘草酸，多糖和甘草酸的含量分別為2.329%和6.562%，該種方法有利于甘草資源的綜合利用。

多糖的提取工藝一般為熱水浸提法，提取周期較長，且多糖中的糖肽類在提取分離時容易發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞。近年來將超聲提取技術(shù)引入到多糖提取工藝中已成為一個研究熱點，主要在于超聲提取法不僅省時、節(jié)能、提取效率高，而且提取中無加熱過程等，有利于多糖類成分的穩(wěn)定［13］。

1.3 超臨界CO2萃取法

超臨界流體萃取技術(shù)(簡稱SFE)是一種以超臨界流體(簡稱SCF或SF)代替常規(guī)有機溶劑對植物有效成分進行萃取和分離的新型技術(shù)。其原理是利用流體(溶劑)在臨界點附近的超臨界區(qū)域內(nèi)與待分離混合物中的溶質(zhì)具有異常相平衡行為和傳遞性能，且對溶質(zhì)的溶解能力隨壓力和溫度的改變而在相當寬的范圍內(nèi)變動，利用超臨界流體作溶劑，可以從多種液態(tài)或固態(tài)混合物中萃取出待分離組分，具有“定向提取分離”的能力［22］。CO2安全、無毒、廉價、不污染環(huán)境，臨界溫度(Tc=31.2℃)和臨界壓力(Pc=7.38 MPa)都較低，因此可在室溫的條件下操作，并且有效成分不易被破壞，此方法在提取純化甘草化學成分方面也有廣泛應用。

王穎等［23］在研究超臨界CO2萃取法提取甘草酸的同時與索氏提取法和傳統(tǒng)水提法進行了比較。結(jié)果顯示超臨界萃取的得率分別是其他兩種方法的11倍和6倍，

付玉杰等［24］采用超臨界CO2萃取法提取甘草次酸，并與索氏提取法、超聲法進行比較。結(jié)果顯示:從甘草生藥中提取含量較少的甘草次酸，超臨界萃取法較其他幾種提取方法具有明顯的優(yōu)勢，提取率是超聲法的5倍，是索氏提取法的13倍。

1.4 微波法

微波輔助提取(Microwave-assisted extraction，MAE)，又稱微波萃取或微波提取，是微波和傳統(tǒng)的溶劑提取法相結(jié)合后形成的一種新型提取技術(shù)。近年來，國內(nèi)外科研工作者將微波技術(shù)應用于天然產(chǎn)物活性成分的提取過程，有效提高了收率，取得了可喜的進展，而且逐漸朝著工業(yè)化方向發(fā)展［25］。目前，微波輔助提取技術(shù)也應用于提取甘草中的有效成分。微波法具有提取快速、節(jié)省時間、節(jié)省溶劑、操作簡便、有效成分提取率高、耗能低等優(yōu)點，缺點是目前設(shè)備較為昂貴。

1.4.1 微波法萃取甘草酸

王巧娥等［26］應用微波萃取甘草中甘草酸，微波萃取54 min與索氏提取4 h、室溫冷浸44.3 h的甘草酸得率相當。

郭錦棠等［27］比較微波提取法與傳統(tǒng)索氏提取法對甘草酸的提取效果。微波輻射8 min的提取效果與索氏提取3 h效果相當，提取速率是索氏的10～20倍。采用微波輔助提取甘草酸也有已經(jīng)申請的專利［28，29］。

1.4.2 微波法萃取甘草黃酮

闞微娜等［30］確定了微波提取甘草黃酮的最佳工藝，提取率為3.0%，與熱回流法提取4 h的結(jié)果接近，大大縮短了提取時間。

張夢軍等［31］通過微波輔助提取法與水提法的比較發(fā)現(xiàn)，微波法提取3 min的提取率(24.6 mg/g)遠遠高于水提法5 h的提取率(11.4 mg/g)，因此微波輔助提取法大大縮短提取時間，且效果顯著。

1.5 半仿生提取法(簡稱SBE法)

半仿生提取法(Semibionic ExtractionMethod，簡稱 SBE法)是根據(jù)中藥藥效物質(zhì)部分已知，大部分未知的現(xiàn)實，利用“灰思維方式”，將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合，從生物藥劑學的角度為經(jīng)消化道給藥的中藥及其復方創(chuàng)立的一種提取新技術(shù)。它模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運的過程，適合工業(yè)化生產(chǎn)，體現(xiàn)中醫(yī)治病綜合成分作用的特點，有利于用單體成分控制制劑質(zhì)量［32］。半仿生提取法提取過程符合口服藥物在胃腸道運轉(zhuǎn)吸收的特點。但是，目前仍采用高溫煎煮的方式，影響某些受熱易分解的有效成分，使藥效大大降低。因此，我們不妨以后把提取溫度改為接近人體的溫度，使提取環(huán)境更接近于人體。

程艷芹等［33］以甘草酸含量、總黃酮含量、總多糖含量、HPLC總面積、浸膏得率等為指標，采用均勻設(shè)計優(yōu)選半仿生提取法的條件。確定其SBE法工藝條件為:三煎用水的pH 值依次為 6.0、7.5、9.0;煎煮時間依次為 2、1、1 h。

1.6 閃式提取法

閃式提取法是指將生物組織加入提取溶劑進行高速組織勻漿，以提取組織中有效成分。該方法可有效縮短提取時間，提高提取效率，簡化操作步驟。

鄧引梅等［34］對比研究了閃式提取、索氏抽提、攪拌提取、超聲波提取4種方法對脹果甘草葉總黃酮的提取效果。結(jié)果表明:閃式提取法所用提取時間短，提取溶劑用量少，是一種高效、快速提取甘草葉中總黃酮的方法。

1.7 負壓空化提取法

負壓空化提取技術(shù)是利用負壓空化氣泡產(chǎn)生強烈的空化效應和機械振動，造成樣品顆粒細胞壁快速破裂，加速了胞內(nèi)物質(zhì)向介質(zhì)釋放、擴散和溶解，促進提取過程。同時負壓空化提取法具有提取溫度低、溶劑用量少、時間短和純度高的特點。并且設(shè)備簡單、易于操作，適于工業(yè)化生產(chǎn)，為中藥提取現(xiàn)代化提供了一種新的方法和手段。

付玉杰等［35］研究表明負壓空化提取法對甘草酸的提取收率是超聲提取法的1.2倍、是索氏提取法的1.7倍。

1.8 超高壓法

超高壓提取(ultrahigh-pressure extraction，UHPE)，也稱超高冷等靜壓提取，是指在常溫下用100～1 000 MPa的流體靜壓力作用于提取溶劑和中藥的混合液上，并在預定壓力下保持一段時間，使有效成分達到平衡后迅速卸壓。由于細胞內(nèi)外滲透壓力忽然增大，細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得細胞內(nèi)的有效成分轉(zhuǎn)移到細胞外的提取液中，達到提取中藥有效成分的目的［36］。

郭文晶等［37］研究了甘草酸的超高壓提取工藝，比回流法約節(jié)省一半溶劑。通過此工藝，甘草酸粗品收率可達11.71%，粗品中甘草酸含量達73.09%。它是一種適合從甘草中快速提取甘草酸的高效、節(jié)能的新方法，用于甘草酸工業(yè)化生產(chǎn)的前景十分廣闊。

2 純化方法

2.1 大孔樹脂法

大孔吸附樹脂是一類不含離子交換基團的交聯(lián)聚合物，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶媒，對有機物有濃縮、分離作用且不受無機鹽類及強離子、低分子化合物的干擾，為一類不同于離子交換樹脂的吸附和篩選性能相結(jié)合的分離材料［38］。大孔樹脂法目前是最常用的純化方法之一，已廣泛應用于皂苷類、黃酮類、苷類和生物堿類等各種化學成分的分離、富集［39］，是迄今為止最適用于工業(yè)化的工藝之一，它的過程主要是吸附和解吸附，所使用的溶劑主要是水和乙醇，工藝簡單、無污染、效率高。它在純化甘草酸和甘草黃酮方面有很好的效果。

2.1.1 大孔樹脂法純化甘草酸

喬五忠等［40］比較了 S-8，NKA-9，NKA-2，D4006，X-5，AB-8，D4020等7種大孔吸附樹脂精制甘草酸，結(jié)果X-5樹脂效果最佳，甘草酸純度可達95.2%。

傅冬和等［41］研究表明，DM-130樹脂對甘草酸的吸附性能好，易于洗脫，分離效果好產(chǎn)品純度可達94.676%。

2.1.2 大孔樹脂法純化甘草黃酮

石忠峰等［42］研究表明，采用95%乙醇提取后直接過AB-8大孔樹脂樹脂柱，收集80%乙醇洗脫部位，減壓濃縮、真空干燥得甘草總黃酮提取物。甘草總黃酮得率在3.4%以上，純度在60%以上。該方法大大節(jié)約了生產(chǎn)成本和工序。

付玉杰等［43］通過篩選 DPH-600，D4020，D101，AB-8，AL-2，NKA-Ⅱ，NKA-9等7種大孔樹脂，確定AB-8為純化異甘草素的最佳樹脂，異甘草素樣品溶液經(jīng)AB-8樹脂吸附與解吸附后回收率為76.7%，純度由2.02%提高29.1%，提高了14.4倍，說明AB-8具有潛在的工業(yè)應用價值。

2.2 聚酰胺法

聚酰胺色譜是由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，其吸附黃酮類化合物的原理是由于其分子內(nèi)部的許多酰胺基和羰基與黃酮混合物形成氫鍵，其形成氫鍵的能力與溶劑有關(guān)，在水中形成氫鍵的能力最強。同時，聚酰胺的膨脹性又可以使被吸附的物質(zhì)滲入其內(nèi)部，從而使其具有較大的吸附容量［44］。

王淑杰等［45］利用聚酰胺柱層析和硅膠柱層析從甘草中分離出單體化合物——甘草查爾酮。

2.3 膜技術(shù)

膜分離過程以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，當膜兩側(cè)存在某種推動力(如壓力差、濃度差、電位差等)時，原料側(cè)組分選擇性地透過膜，以達到分離、提純的目的［46］。

高林霞等［47］采用膜分離技術(shù)，與傳統(tǒng)工藝相比甘草酸的回收率提高到10%，并且一步得到60%的高純度甘草酸，解決了重結(jié)晶難、收率低的問題。

2.4 泡沫分離法

泡沫分離技術(shù)是一種基于溶質(zhì)間表面活性的差異，以泡沫形式提供氣液界面，分離濃縮表面活性溶質(zhì)的分離方法。該技術(shù)具有設(shè)備簡單、易于操作、成本低、分離效果好等特點，已在選礦、污水處理、生化工程等領(lǐng)域得到廣泛應用。在中藥領(lǐng)域中，甘草酸是甘草中一重要成分，由2分子葡萄糖醛酸和甘草次酸組成，易溶于水，是一種良好的天然表面活性成分，因此，該技術(shù)特別適合應用于甘草酸的分離。

蘇艷桃等［48］對間歇式泡沫分離提取甘草中甘草酸的工藝進行了研究，泡沫相中甘草酸的回收率為91.9%。

2.5 高速逆流色譜法

高速逆流色譜技術(shù)(high-speed counter-current chromatography technique，HSCCC)，是一種不用任何固態(tài)載體或支撐體的液-液分配色譜技術(shù)，目前已成功地開發(fā)出分析型、生產(chǎn)型兩大類高速逆流色譜儀，可分別用于中藥有效成分的定量分析和分離制備。因為HSCCC分離過程無需固定相，所以可以避免形成死吸附，大大減少了有效成分分離過程中的損失、變性，特別適合于一些微量成分的分離、制備。

王巧娥等［49］采用高速逆流色譜法，從脹果甘草的乙醇粗提物中分離純化甘草查爾酮甲和脹果香豆素甲。

高蕾［50］采用高速逆流色譜法，從烏拉爾甘草中分離純化出甘草黃酮醇、甘草素、芒柄花素、甘草異黃酮甲4種黃酮類化合物。此外，利用半制備型高速逆流色譜，一步就成功的從甘草的粗提物中分離出甘草素和異甘草素［51］、利用高速逆流色譜分離出甘草苷［52］也有報道。

2.6 其他方法

此外還有利用雙水相體系提取甘草酸單銨鹽［53，54］，采用模擬移動床色譜技術(shù)提純甘草苷［55］的研究報道。

3 小結(jié)與討論

甘草作為最常用的中藥之一，對其化學成分的研究一直受到各國學者的重視，迄今為止，已從甘草屬植物中已分離得到61種三萜類化合物［56］，300多種黃酮類化合物［57］。但目前以甘草單體成分作為主成分的上市藥品多以甘草酸及其衍生物為主，不少廠家在提取甘草酸及其衍生物時，產(chǎn)生了大量含有甘草黃酮的廢渣，不僅污染了環(huán)境，還造成了甘草資源的極大浪費。但甘草中除了甘草酸及其衍生物有藥理活性外，甘草黃酮也被證明有多種藥理活性。因此我們有必要加大提取甘草黃酮工藝的研究力度，早日將其開發(fā)成新藥，這樣一方面可以避免環(huán)境的污染，提高甘草資源的利用率，又可以增加經(jīng)濟效益和社會效益。

甘草有效成分的提取純化方法多種多樣，既有傳統(tǒng)的工藝(如溶劑提取法)，又有現(xiàn)代高科技技術(shù)手段(如高速逆流色譜技術(shù))，但各種方法都各有利弊，可以根據(jù)化學成分的性質(zhì)，采取不同的提取純化方法，如提取甘草酸和甘草黃酮時時可以選擇本文提到的幾乎所有方法，而純化甘草酸時可以選擇大孔樹脂法、膜技術(shù)、泡沫分離法;純化甘草黃酮時可以選擇大孔樹脂法、聚酰胺法、高速逆流色譜法。近年來，甘草中新的化合物不斷發(fā)現(xiàn)，其中很多都是微量成分，像這種用傳統(tǒng)提取純化方法很難被分離出來，但卻推動了提取純化技術(shù)的發(fā)展，如制備、半制備型高效液相色譜法，高速逆流色譜法的迅速發(fā)展使有效成分的分離定位更準確，更靈敏。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，各種新型的技術(shù)，如分子印跡技術(shù)［58］、酶法提取技術(shù)［59］等，都可以應用于甘草有效成分的研究中，同時也可以多種提取純化技術(shù)相結(jié)合，取長補短，優(yōu)選出效率高、成本低、重現(xiàn)性好的提取純化工藝。

以提高甘草有效成分的得率、純度為目的的提取純化方法成為研究熱點之一，這樣不僅可以大大節(jié)約寶貴的甘草資源，而且為甘草全面、綜合的合理開發(fā)與利用提供了科學的技術(shù)支持。我們相信，隨著提取純化技術(shù)的日趨成熟、完善，甘草資源的合理開發(fā)與利用必將得到很好的發(fā)展，這些技術(shù)的發(fā)展與應用必將在生產(chǎn)實踐中給社會帶來更多的好處。那么，甘草提取純化工藝的研究會成為甘草研究的又一重要熱門領(lǐng)域。

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