王書(shū)美，張連峰

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

脊椎動(dòng)物調(diào)寧蛋白（calponin）是一個(gè)家族，按其等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）分為堿性調(diào)寧蛋白（h1 calponin，h1CaP，pI 8～10），中性調(diào)寧蛋白（h2 calponin，h2CaP，pI7～8），酸性調(diào)寧蛋白（h3 calponin，h3CaP，pI5～6）。h2CaP與h1CaP有很高的同源性，主要分布于心肌組織中，人角化細(xì)胞中也有其存在。h3CaP廣泛表達(dá)，但在腦組織中含量最豐富。這3個(gè)成員的前273個(gè)氨基酸殘基具有很高的同源性（＞70％），都是由單一CH結(jié)構(gòu)域（calponin homologydomain）和29個(gè)氨基酸殘基組成的CLR（calponin-like repeat）三拷貝串聯(lián)重復(fù)序列組成。但它們的羧基末端序列有較大的差異。

h1CaP是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族成員［1］，主要表達(dá)于終末分化和非增殖性的平滑肌細(xì)胞中，含量與原肌球蛋白（tropomyosin）相似，為肌動(dòng)蛋白的1/7。Takahashi等［2］首先從雞砂囊平滑肌組織中提純出h1CaP，隨后，證實(shí)血管、胃、子宮、輸尿管、膀胱和輸精管等組織的平滑肌細(xì)胞中均有h1CaP表達(dá)。h1CaP主要在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，具有很強(qiáng)的組織特異性，參與平滑肌收縮的調(diào)控。

1 堿性調(diào)寧蛋白的分子生物學(xué)特點(diǎn)

編碼人h1CaP的CNN1基因位于19p13.2，小鼠的cnn1基因位于9q，大鼠的cnn1基因位于8q。編碼人h1CaP的cnn1基因跨度超過(guò)11kb，包含7個(gè)外顯子，人h1CaP為一297個(gè)氨基酸的蛋白［3，4］。

h1CaP分子結(jié)構(gòu)主要由氨基末端的單一CH結(jié)構(gòu)域和羧基末端的CLR多拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列組成［5］。單一CH結(jié)構(gòu)域與MAPK（mitogen—activated protein kinase）信號(hào)途徑中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated kinase，ERK）直接相互作用［6］，可能有利于信號(hào)分子定位于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。CLR結(jié)構(gòu)域是由29個(gè)氨基酸組成的一個(gè)獨(dú)立單元，以單個(gè)或多個(gè)拷貝串聯(lián)重復(fù)而形成的一種結(jié)構(gòu)方式，該結(jié)構(gòu)是calponin蛋白家族的一個(gè)重要特征。目前認(rèn)為，CLR具有穩(wěn)固肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的作用。h1CaP的羧基端有3個(gè)CLR，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)（actin binding site，ABS），稱為ABS2。CLR非競(jìng)爭(zhēng)性與肌動(dòng)蛋白結(jié)合是其穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白纖維的重要因素之一。此外，在h1CaP，CLR結(jié)構(gòu)域的氨基端142-163個(gè)氨基酸區(qū)域也具有肌動(dòng)蛋白結(jié)合功能，稱為ABS1（actin binding site 1），但缺失ABS1的h1CaP仍然具有肌動(dòng)蛋白結(jié)合活性［7］。

2 堿性調(diào)寧蛋白的生物學(xué)作用

20世紀(jì)90年代，h1CaP作為平滑肌分化的標(biāo)記，研究者的研究主要集中在其結(jié)合肌動(dòng)蛋白，抑制肌球蛋白ATP酶（myosin ATPase，簡(jiǎn)稱ATP酶）方面。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)h1CaP可調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，認(rèn)為h1CaP可作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合分子，這種作用主要表現(xiàn)在控制基于肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞進(jìn)程上。現(xiàn)在研究也表明h1CaP不僅作為平滑肌分化的可靠標(biāo)記，還可預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后情況。

2.1 h1CaP參與平滑肌收縮的調(diào)控

平滑肌收縮的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞包括肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）兩條途徑.MLCK使肌球蛋白輕鏈上絲氨酸-19磷酸化，PKC使h1CaP和Caldes mon（另一種平滑肌調(diào)控蛋白）磷酸化，導(dǎo)致ATP酶活性增加，平滑肌收縮［8］。

h1CaP結(jié)合肌動(dòng)蛋白的細(xì)肌絲，原肌球蛋白，鈣調(diào)蛋白，抑制肌動(dòng)蛋白活化的肌球蛋白Mg-ATPase活性和在固定化的肌球蛋白抑制Ca2+-依賴的肌動(dòng)蛋白的移動(dòng)性［1，9-12］，誘導(dǎo)F-肌動(dòng)蛋白絲的構(gòu)象改變和通過(guò)肌球蛋白減少橫橋周期，增加最大力度的產(chǎn)生［13，14］。

2.2 參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

調(diào)寧蛋白除了結(jié)合肌動(dòng)蛋白外，還與很多蛋白配體結(jié)合，其中許多參與信號(hào)通路。h1CaP具有多個(gè)信號(hào)分子蛋白的結(jié)合域，如ERK，PKC等都可與它結(jié)合。這些信號(hào)傳導(dǎo)通路與各種調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖的物質(zhì)之間均存在著廣泛的聯(lián)系，h1CaP可能就在其中發(fā)揮著重要的作用。

h1CaP還可以被多種激酶磷酸化，有報(bào)告指出h1CaP是MAPK［15］，rho激酶［16］，PKC［17］多種激酶的底物，表明h1CaP除了調(diào)節(jié)平滑肌收縮，還可能通過(guò)細(xì)胞間的粘接、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞分化和增殖參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.3維持細(xì)胞骨架

h1CaP作為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白，可通過(guò)與F-肌動(dòng)蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)。h1CaP主要有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一是肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)域，能與肌動(dòng)蛋白的羧基端結(jié)合，從而阻抑肌動(dòng)蛋白對(duì)ATP酶的激活作用。二是鈣調(diào)蛋白結(jié)合域，有人推測(cè)，h1CaP與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后.會(huì)逆轉(zhuǎn)前者對(duì)ATP酶的抑制。

在體外，h1CaP結(jié)合磷脂，特別是帶負(fù)電荷的如磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇［18］，連接不同類型細(xì)胞的質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞受激動(dòng)劑刺激時(shí)，h1CaP從細(xì)胞骨架向質(zhì)膜易位［15］。

2.4參與血管病變及腫瘤的基因調(diào)節(jié)

h1CaP作為平滑肌細(xì)胞分化的標(biāo)志物，除了調(diào)節(jié)平滑肌收縮之外，還能抑制細(xì)胞增生。過(guò)表達(dá)的h1CaP能抑制多種細(xì)胞的增生，而其表達(dá)降低或缺失則見(jiàn)于許多細(xì)胞增生性疾病。在許多種人類軟組織和骨瘤中發(fā)現(xiàn)h1CaP蛋白和mRNA的表達(dá)，包括卡波西肉瘤，骨肉瘤，平滑肌肉瘤，骨的成纖維細(xì)胞瘤，滑膜肉瘤，惡性纖維細(xì)胞瘤，脂肪肉瘤，惡性神經(jīng)鞘瘤，胃腸道基質(zhì)瘤，副脊索瘤，以及唾液腺的肌上皮癌等，h1CaP在這些軟組織和骨瘤中表達(dá)均比正常組織下調(diào)。

Negoro等［19］發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化的早期（內(nèi)膜無(wú)增生或輕度增生），大部分中層平滑肌細(xì)胞表達(dá)h1CaP，而處于增殖及向內(nèi)膜遷移狀態(tài)的平滑肌細(xì)胞不表達(dá)h1CaP。Takahashi等［20］利用兔頸動(dòng)脈球囊損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，血管損傷早期管壁中層平滑肌細(xì)胞h1CaP表達(dá)下調(diào)，同時(shí)伴有平滑肌細(xì)胞數(shù)量增加。Taniguchi等［21］在正常的小鼠和h1CaP缺陷小鼠中注射B16黑色素瘤細(xì)胞，在h1CaP缺陷小鼠的肺中發(fā)現(xiàn)更多的遷徙小瘤。這是因?yàn)閔1CaP缺陷小鼠的血管沒(méi)有完全發(fā)育成熟，非成熟的血管結(jié)構(gòu)上脆弱，增加了癌細(xì)胞的血源性轉(zhuǎn)移。h1CaP的缺失妨礙腫瘤新血管的形成及成熟，說(shuō)明h1CaP參與血管病變的基因調(diào)節(jié)。

最近的研究表明攻擊性的腫瘤擴(kuò)散與周圍間質(zhì)細(xì)胞中h1CaP及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的減少有關(guān)。在基因敲除實(shí)驗(yàn)中，h1CaP缺陷小鼠在一些組織中表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)脆性，例如血管，子宮，腹膜，導(dǎo)致癌癥細(xì)胞造血轉(zhuǎn)移和腹膜散布［21］。經(jīng)h1CaP治療后，腹膜疾病被抑制，這表明h1CaP通過(guò)穩(wěn)定腹膜防御腫瘤散布。

近年來(lái)，在平滑肌肉瘤，人類惡性黑素瘤，肝細(xì)胞癌，腎細(xì)胞癌，結(jié)腸癌等的血管中發(fā)現(xiàn)h1CaP表達(dá)下降。用h1CaP轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞、纖維肉瘤HT1080細(xì)胞或平滑肌肉瘤細(xì)胞可抑制細(xì)胞增殖和致瘤性。在平滑肌肉瘤中（一種子宮平滑肌新生物），h1CaP表達(dá)減少，將h1CaP轉(zhuǎn)染人類平滑肌肉瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)h1CaP可抑制腫瘤細(xì)胞增殖［22］。黑素瘤細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)表明h1CaP表達(dá)水平升高可減少細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)［23］。臨床上肝細(xì)胞癌患者血管中h1CaP表達(dá)下降，促腫瘤血管成熟的h1CaP表達(dá)較高的肝細(xì)胞癌患者無(wú)瘤生存率明顯更高，且肝細(xì)胞癌患者h(yuǎn)1CaP的表達(dá)水平與疾病的預(yù)后相關(guān)，h1CaP蛋白表達(dá)的免疫組化分析可作為預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者肝切除后預(yù)后情況的新方法［24］。Islam等［25］在腎細(xì)胞癌的侵潤(rùn)性瘤，肉瘤等發(fā)現(xiàn)h1CaP表達(dá)較低，h1CaP維持血管完整性的功能不能較好的發(fā)揮，腎腫瘤血管中h1CaP的表達(dá)可作為腎細(xì)胞瘤的一種新的重要的病理學(xué)因子。Kaneko等［26］在v-src轉(zhuǎn)化的大鼠成纖維細(xì)胞系SR-3Y1中發(fā)現(xiàn)，h1CaP主要通過(guò)減少血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)和血管發(fā)生，發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。Yanagisawa等［27］也發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織周圍區(qū)域的血管h1CaP的表達(dá)隨著腫瘤進(jìn)展，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管浸潤(rùn)和復(fù)發(fā)顯著降低。癌組織周圍區(qū)域h1CaP的表達(dá)與VEGF呈負(fù)相關(guān)。Takeoka等［28］發(fā)現(xiàn)h1CaP基因通過(guò)穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲，增強(qiáng)integrinα5β1系統(tǒng)的粘連抑制人類纖維肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，Suzuki等［29］的預(yù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)急性主動(dòng)脈壁夾層形成病人的h1CaP水平比對(duì)照組高，可作為急性主動(dòng)脈壁夾層形成的早期診斷標(biāo)志。

大量增加的證據(jù)表明，h1CaP為調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)鍵分子之一。在癌組織的血管中h1CaP的表達(dá)水平結(jié)合常規(guī)的腫瘤分類操作可作為癌癥轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有用的診斷標(biāo)記。作為腫瘤抑制因子，h1CaP有用于基因治療的巨大潛力，用h1CaP基因治療癌癥可能有效地抑制腫瘤的惡性擴(kuò)散和保護(hù)宿主正常組織免受癌細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 小結(jié)

堿性調(diào)寧蛋白是一種分化標(biāo)志蛋白，在分化型平滑肌細(xì)胞中大量表達(dá)。它通過(guò)與肌動(dòng)蛋白相結(jié)合，參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)，具有多種生物學(xué)功能。其表達(dá)改變與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，研究其生化特征及生化分子機(jī)理，能為預(yù)防和治療平滑肌相關(guān)疾病及腫瘤，提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。調(diào)寧蛋白行使腫瘤抑制因子的功能，將h1CaP互補(bǔ)DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)未分化的腫瘤細(xì)胞具有潛在的治療價(jià)值。

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