鐘妮娜，彭衛(wèi)萍，王定檢，白益民

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 625014)

寵物犬黑熱病的診斷與防控

鐘妮娜，彭衛(wèi)萍，王定檢，白益民

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 625014)

黑熱病(Kala-azar)又稱內(nèi)臟利什曼病(Visceral leishmaniasis，VL)，是由杜利什曼原蟲(Leishmania donovani)引起，經(jīng)白蛉(Phlebotomus species)傳播所致人獸共患的一種慢性寄生蟲性疾病。該病嚴(yán)重危害人類健康，是世界衛(wèi)生組織的重要目標(biāo)疾病之一。本文綜述了人與寵物犬共患的黑熱病的診斷與防控研究進(jìn)展，為采取更具針對性的預(yù)防控制措施提供參考依據(jù)。

黑熱病;杜利士曼原蟲;診斷與防控

內(nèi)臟利什曼病主要分布在亞洲、非洲、歐洲及拉丁美洲的熱帶與亞熱帶地區(qū)，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球大約88個國家的1200萬人口受到該病的感染，約3.5億人受到感染的威脅。在我國，近年來主要在四川、甘肅、陜西、山西、新疆和內(nèi)蒙古等地每年都有病例發(fā)生，且多集中于川北和隴南。20世紀(jì)90年代以來，各地開展大規(guī)模以滅犬為主的防治措施后，雖使病例有所減少，但仍不斷有病例發(fā)生。2010年5月至8月，作者和課題組成員對九寨溝縣、黑水縣、北川縣、茂縣、汶川縣五個縣(農(nóng)村)的犬只進(jìn)行黑熱病流行病學(xué)調(diào)查，采集645頭份全血樣品，其中有寵物犬42頭，作熒光定量 PCR診斷，檢測結(jié)果寵物犬陽性率占6.5%。在白蛉密集活動地如地中海西西里(Sicily)島的卡塔尼亞(Catania)地區(qū)，每年經(jīng)醫(yī)院診斷的病例在10～15人之間，在1996和1997年分別報道的38和37例內(nèi)臟利什曼病中有4例均是家中養(yǎng)有寵物犬的美國駐軍或家屬。由此看來，與人親密接觸的寵物犬的利什曼原蟲病直接影響和威脅著人類的健康和生命。

寵物犬的利什曼病有多種類型，常見的有內(nèi)臟型和皮膚型兩種，不同種或亞種的利什曼原蟲感染后所致利什曼病的臨床表現(xiàn)各不相同。內(nèi)臟利什曼原蟲病病原體主要有杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、嬰兒利什曼原蟲(Leishmania infantum)和恰氏利什曼原蟲(Leishmania chagasi)。本病的傳播依靠適宜的保蟲宿主、媒介和敏感宿主。保蟲宿主主要為患者與病犬，皖北和豫東以北平原地區(qū)以患者為主，西北高原山區(qū)以病犬為主;傳播媒介是中華白蛉和羅蛉，傳播途徑是通過白蛉或羅蛉叮咬傳播，偶可經(jīng)破損皮膚和黏膜、胎盤或輸血傳播;人群普遍易感，病后有持久免疫力。健康人也可具有不同程度的自然免疫性。

1 臨床及病理變化

寵物犬感染利什曼原蟲后，病變早期眼觀不明顯，晚期則常出現(xiàn)體弱、消瘦、精神萎靡、面色蒼白、皮膚損害干燥(表現(xiàn)為脫毛、皮脂外溢、結(jié)節(jié)和潰瘍，以頭部尤其是耳、鼻、唇部、面部兩側(cè)和眼睛周圍最為顯著，有“癩皮狗”之稱)、腹部膨隆(肝、脾腫大所致)、淋巴結(jié)腫大、甚至出現(xiàn)惡病質(zhì)。在印度特別是膚色淺的人，手足、腹部和面部皮膚變灰色，故稱黑熱病。

白蛉在夜間活動，每年的7～9月最多，當(dāng)雌性白蛉叮咬病人和受染哺乳動物時，鞭毛型蟲體進(jìn)入機體后在單核－巨噬細(xì)胞內(nèi)脫去鞭毛轉(zhuǎn)變?yōu)闊o鞭毛體，并在白蛉叮咬部位形成由充滿無鞭毛體的組織細(xì)胞組成的肉芽腫，隨后無鞭毛體相繼擴散到局部淋巴結(jié)和全身各處，刺激肉芽腫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在骨髓、淋巴結(jié)、皮膚和其他器官可發(fā)現(xiàn)感染的單核－巨噬細(xì)胞，特別是在脾、肝、骨髓和淋巴結(jié)的巨噬細(xì)胞中更易發(fā)現(xiàn)。蟲體增加到一定程度后脹破巨噬細(xì)胞，游離后再侵入其他巨噬細(xì)胞，如此反復(fù)引起巨噬細(xì)胞的大量破壞和極度增生，導(dǎo)致脾、肝和淋巴結(jié)明顯腫大。

2 診斷方法

診斷本病應(yīng)根據(jù)癥狀、流行病學(xué)、病原和血清學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判定。對于寵物犬診斷若能結(jié)合病理學(xué)變化將大大提高檢測速度。由于黑熱病導(dǎo)致宿主各項免疫功能低下進(jìn)而誘發(fā)混合感染，較容易造成誤診，因此尋找有效可靠的診斷方法尤為重要。

2.1 顯微鏡檢法

一般指組織染色鏡檢、免疫組織化學(xué)法及體外培養(yǎng)原蟲三種方法。采取皮膚病變的結(jié)節(jié)內(nèi)容物(或采取脾臟、骨髓及淋巴結(jié)穿刺物)作涂片，用姬姆薩或瑞氏染色觀察，檢查利什曼原蟲的無鞭毛體形態(tài)。組織染色鏡檢準(zhǔn)確性較高，查出病原體為診斷依據(jù);用免疫過氧化物酶染色鑒定感染組織中的無鞭毛體形態(tài)敏感性較高，但對發(fā)病前期犬只的檢出率不高;因涂片中無鞭毛體小、數(shù)量少，又無明顯運動，故用體外培養(yǎng)方法可提高陽性檢出率。取病犬脾、骨髓、淋巴結(jié)抽取物培養(yǎng)于 Schneider或NNN培養(yǎng)基等，于22℃～26℃培養(yǎng)數(shù)天便可見到大量活動的前鞭毛體。

2.2 常規(guī)PCR法

一般包括以 ITS即基因組DNA和 kDNA兩種基因組為靶基因來進(jìn)行的PCR以及巢式PCR、PCRELISA等。其中以 ITS為靶基因?qū)τ谄⑴K、淋巴結(jié)的原蟲檢出率有較高的敏感性，但對于血液的檢出率較低;以kDNA為靶基因的這種方法對于淋巴結(jié)、骨髓和脾臟有較高的檢出率，但對于嬰兒利什曼原蟲的敏感性較低，適合于常規(guī)檢測;巢式PCR是一種敏感、特異的診斷犬VL的方法，提取白細(xì)胞比抽取骨髓和淋巴結(jié)穿刺更好在現(xiàn)場推廣;PCR－ELISA法特點在于PCR法的定性和ELISA的定量相結(jié)合，特別適合于低蟲荷的患者、病犬以及局部潰瘍刮取標(biāo)本的檢測。

2.3 熒光定量PCR法

相對于其他方法，熒光定量PCR具有較高的敏感性，特別是對寵物犬血液的檢測十分敏感，且能定量檢測蟲體數(shù)。

2.4 血清抗體檢測

黑熱病患者一般利什曼原蟲抗體水平高。檢測血清抗體的常見方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、間接熒光試驗(IFA)、直接凝集試驗(DAT)、免疫印跡試驗(IA)、乳膠凝集試驗(LAT)。此外還有間接血凝試驗(IHA)、對流免疫電泳(CIE)、補體結(jié)合試驗(CF)。其中IFA的特異性和敏感性都很高，DAT(包括杜氏利什曼原蟲凝集抗體)為 97.2%，ELISA為 75%，CIE為 84.3%～97.2%，免疫印跡試驗則是一種敏感的、非侵入性、特異的黑熱病診斷方法。微量凝集板節(jié)約抗原，方法簡便快速且經(jīng)濟(jì)安全，適宜現(xiàn)場應(yīng)用。通常寵物診療機構(gòu)常用血凝濃度＞16滴度就能初步診斷為利什曼感染。

2.5 血清循環(huán)抗原檢測

常用方法有單克隆抗體－抗原斑點試驗(McAb－AST)、Dipstick 法、乳膠凝集試驗(LA)。McAb－AST方法陽性率可達(dá)94%～100%，敏感性、特異性和重復(fù)性均較好，簡易可行僅需微量血清即可;Dipstick法是將免疫分子親和原理和免疫印跡法、經(jīng)典的薄層層析技術(shù)想結(jié)合，敏感性高、操作簡便、報告結(jié)果快速;乳膠凝集試驗適用于現(xiàn)場調(diào)查，操作簡便且特異性可達(dá)100%。此外還有單克隆抗體－酶聯(lián)免疫印漬技術(shù)(McAb－EITB)和雙抗體夾心斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(Sandwish Dot－ELISA)等方法。

3 治療及預(yù)防

3.1 治療

為避免疾病的蔓延傳播，建議撲滅被確診的黑熱病犬只以消除后患，如在一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū)一旦確診便會實施安樂死。但鑒于寵物犬與人類關(guān)系密切，朝夕相伴，對寵物犬黑熱病的治療也有一些資料報道。對人類的治療最常用的藥物主要包括五價銻化合物、戊烷脒、兩性霉素B、別嘌呤醇等。

五價銻化合物包括葡萄糖酸銻鈉和甲基葡萄糖胺銻。通過選擇性的抑制利什曼原蟲的糖酵解及脂肪酸氧化作用，五價銻化合物有明顯的臨床療效，復(fù)發(fā)較少。但其降解物三價銻毒性較大且近幾年不斷發(fā)現(xiàn)對銻劑耐藥或療效不佳的病例;戊烷脒排泄緩慢易造成中毒，治療后復(fù)發(fā)率較高，故只用于對銻制劑治療無效的患者;兩性霉素B選擇性地與利什曼原蟲的麥角固醇前體相結(jié)合從而損傷膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，因此小劑量的兩性霉素B對其有選擇性毒性作用;別嘌呤醇與五價銻有協(xié)同作用，對利什曼原蟲有明顯毒性;反烏頭酸為其酶的抑制劑，能抑制原蟲的能量代謝，在體外與其他抗原蟲藥聯(lián)用，能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)原蟲的轉(zhuǎn)化與增值;甘草查爾酮A屬甘草黃酮類化合物，具有多種生物活性，能完全抑制利什曼原蟲前鞭毛體增值，有強大的細(xì)胞內(nèi)殺原蟲作用。無鞭毛體對其更加敏感，且藥物濃度大小對宿主細(xì)胞的毒性作用都不明顯。

3.2 預(yù)防

免疫預(yù)防集中在應(yīng)用重組利什曼原蟲抗原和合適的佐劑研制疫苗，誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，因此免疫佐劑的選擇十分重要。以超聲波破碎巴西利什曼原蟲前鞭毛體制備的可誘性抗原搭配佐劑在臨床上已得到驗證，對利什曼病具有良好的預(yù)防作用。

全蟲疫苗是以活的或死的利什曼原蟲前鞭毛體作為免疫接種抗原，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對利什曼原蟲的免疫力，包括活疫苗及減毒活疫苗。直接以活前鞭毛體感染人體后，容易造成機體免疫力低下及經(jīng)久不愈的皮膚損害，因而轉(zhuǎn)向減毒活疫苗及滅活疫苗的研究，一般是通過射線照射、基因滅活或置換等方法。減毒后的利什曼原蟲雖沒有完整的復(fù)制周期，但仍能長時間地在機體內(nèi)存活，誘導(dǎo)保護(hù)性免疫力的產(chǎn)生;滅活疫苗是由人工大量培養(yǎng)的前鞭毛體經(jīng)理化方法滅活后制成的一類疫苗;重組抗原疫苗是指利用基因重組技術(shù)，將經(jīng)篩選的、能有效誘導(dǎo)保護(hù)性免疫力產(chǎn)生的病原體抗原的編碼基因引入細(xì)菌、病毒的基因組內(nèi)，通過細(xì)菌、病毒的繁殖而獲取大量相應(yīng)的抗原，所獲抗原經(jīng)分離、提純后用于免疫接種。它包括了從克隆利什曼原蟲基因獲得的免疫蛋白和從轉(zhuǎn)化表達(dá)載體提純的免疫蛋白;非蛋白抗原疫苗是指利什曼原蟲前鞭毛體表膜上的多糖與膜上的脂類結(jié)合成大分子的糖脂進(jìn)而誘發(fā)保護(hù)性免疫力;重組活載體疫苗是將編碼病原體有效免疫原的基因插入載體(減毒的病毒或細(xì)菌疫苗株)基因組中，接種后，隨疫苗株在體內(nèi)的增殖，大量所需的抗原得以表達(dá)，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對相應(yīng)病原體的免疫保護(hù)力;DNA疫苗是用編碼病原體有效免疫原的基因與真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的重組體直接免疫機體，通過宿主細(xì)胞攝取并表達(dá)保護(hù)性抗原，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫的疫苗。其誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)性免疫應(yīng)答可以達(dá)到預(yù)防和治療的目的。

3.3 生物防控

鑒于白蛉是黑熱病重要的傳播媒介，控制白蛉便是消滅黑熱病的根本措施。在白蛉覓食期間，可在白蛉活動的有限范圍內(nèi)，如人群居住環(huán)境和居室內(nèi)滯留噴灑殺蟲劑，并在身體裸露部位涂驅(qū)避劑。使用2.5%溴氰菊脂浸泡過的蚊帳或安裝紗門、紗窗對家棲和近家棲白蛉預(yù)防效果明顯;而犬作為黑熱病的重要保蟲宿主，對黑熱病的傳播作用不可忽視，故在犬源型黑熱病流行區(qū)應(yīng)以查治和捕殺病犬，消滅傳染源為主。

黑熱病的治療和預(yù)防面臨挑戰(zhàn)，在人們從事生產(chǎn)建設(shè)過程中，人與動物之間密切接觸(尤其在犬成為寵物或伴侶后)、人的飲食習(xí)慣和宗教習(xí)俗、環(huán)境污染、地質(zhì)災(zāi)害(如2008年地震災(zāi)害)等都有可能引起人獸互傳。同時，隨著改革開放，國外帶病犬進(jìn)入國內(nèi)市場，應(yīng)加強檢疫，防止國外人獸共患病進(jìn)入我國。

現(xiàn)代社會節(jié)奏的加快使得寵物對人類的生活影響加大，成為人類生活的忠實伴侶。對寵物人類不可過于親近，要保持適宜的距離避免人獸共患病的感染并且定期到醫(yī)院進(jìn)行體檢，做到早發(fā)現(xiàn)早治療。獸醫(yī)工作者不但要做好本職工作，認(rèn)識到疾病預(yù)防保護(hù)是獸醫(yī)工作的重要組成部分，還要做好宣傳;不僅要了解利什曼病的新動態(tài)，還要使寵物愛好者了解如何飼養(yǎng)合格的犬。同時，政府也應(yīng)該加大宣傳力度并政策化黑熱病的預(yù)防工作，組織獸醫(yī)工作者接受正規(guī)的專業(yè)培訓(xùn)提升他們的業(yè)務(wù)能力。近年來雖然各個地方都采取了一些有效的措施來控制寵物犬免受寄生蟲和傳染病的侵害，但徹底地防控寵物疾病的任務(wù)仍然任重道遠(yuǎn)。

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Diagnosis and Control of Kala Azar in the Pet Dogs

ZHONG Ni－na，PENG Wei－ping，WANG Ding－jian，BAI Yi－min
(Animal Medical College，Sichuan Agricultural University，Sichuan 625014，China)

Kala－azar，also named as visceral leishmaniasis(VL)，is an important chronic zoonotic parasitic disease that is potentially fatal to humans and dogs.It is caused by Leishmania donovani and its transmission vector is sandfly.Leishmaniasis is one of World Health Organization’s profitable target diseases for its bad effect on humans.This article summarizes and makes a prospect of diagnosis and prevention of leishmanasis，and gives suggestions on adopting more effective measures to control this parasitic disease.

Kala－azar;Leishmania donovani;Diagnosis;Prevention

R33;R184

A

1671－7856(2010)11、12－0156－04

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.11、12.038

2010－08－20

鐘妮娜，教授，E－mail:Zhongnina45@yahoo.com.cn。