屈會化，趙琰，盧建秋，王慶國

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

綜述·進(jìn)展

缺血性中風(fēng)動物模型研究現(xiàn)狀

屈會化，趙琰，盧建秋，王慶國

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

利用實(shí)驗(yàn)動物或細(xì)胞模型完全模擬人類的中風(fēng)十分困難，動物模型與臨床的擬合具有重要意義。本文對目前缺血性中風(fēng)動物模型研究中的實(shí)驗(yàn)動物選擇、模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及造模方法，以及主要局灶缺血模型的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行述評，為缺血性中風(fēng)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究選擇合適的實(shí)驗(yàn)動物模型提供參考。

缺血性中風(fēng);動物模型;大腦中動脈閉塞

缺血性中風(fēng)是由大腦主動脈或其分支血栓形成，或內(nèi)栓子阻塞引起，且多為大腦中動脈(MCA)栓塞。利用實(shí)驗(yàn)動物或細(xì)胞模型完全模擬人類的中風(fēng)十分困難，過去二十年，經(jīng)動物模型研究證明有效的700多種藥物中，除一種新自由基消減劑(NXY－059)外，其余全都未能在三期臨床得到陽性結(jié)果，從而無法證明其有效性，這使研究人員更認(rèn)識到動物模型與臨床擬合的重要意義。本文對目前缺血性中風(fēng)動物模型的研究現(xiàn)狀進(jìn)行述評。

1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇

在腦缺血基礎(chǔ)與新藥研發(fā)工作中，選擇恰當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ褪欠浅Ｖ匾摹Ｈ毖灾酗L(fēng)動物模型中使用的實(shí)驗(yàn)動物有兩大類:即靈長類和嚙齒類。對于中風(fēng)的生理病理的了解，最初來源于中風(fēng)患者。因此，靈長類動物對中風(fēng)的基礎(chǔ)研究具有重要作用。與人類相似的多腦回靈長類動物種屬(如獼猴)，在行為和感覺運(yùn)動整合方面與人類有密切的相似性，是中風(fēng)基礎(chǔ)研究、探索性研究和臨床前評價(jià)的最佳動物模型。利用非人靈長類動物制備模型，已有了幾十年的經(jīng)驗(yàn)積累，如狒狒。1999年國際中風(fēng)治療學(xué)術(shù)產(chǎn)業(yè)圓桌會議(STAIR會議)提出，藥物一旦用小動物做出陽性結(jié)果，應(yīng)該在較高的物種進(jìn)行驗(yàn)證，然后才能開始臨床試驗(yàn)［1］。最近報(bào)道，利用狨猴模型發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)藥物氯美噻唑。國內(nèi)也有學(xué)者采用光化學(xué)法成功造成樹鼩局部腦缺血模型［2］，其造模方法亦被多人借鑒采納。但是，到目前為止，尚無標(biāo)準(zhǔn)化的、被廣泛接受的靈長類動物中風(fēng)模型。

與靈長類較大的動物相比，嚙齒類動物模型，如大鼠和小鼠，具有價(jià)格便宜、來源充足、品種純化、制作模型方法簡單、存活率高、腦血管解剖和生理較接近于人類、易于監(jiān)測生理參數(shù)，腦標(biāo)本制作容易等多面的優(yōu)勢［3－5］，也符合1999年STAIR會議有關(guān)腦缺血動物模型研究的建議，廣泛用于腦缺血及缺血再灌注模型，在研究工作中發(fā)揮著不可替代的作用［1］。但是嚙齒類動物的大腦與人和非人靈長類動物的大腦存在差異，對于相同的缺血損傷的反應(yīng)可能不同。如何將動物的給藥方案擴(kuò)大到人體一直是個(gè)難題，包括給藥劑量和療程。例如嚙齒類動物模型在中風(fēng)后的第一周就可恢復(fù)，而人類中風(fēng)后恢復(fù)需要較長的時(shí)間，可能需要幾個(gè)月。給藥劑量也存在同樣的問題。一些全身給藥的藥物可根據(jù)體重進(jìn)行校正，而一些蛋白質(zhì)和生長因子類藥物，必須腦內(nèi)注射給藥，可根據(jù)大腦表面積或體積進(jìn)行推算。如果沒有靈長類動物模型，以及相應(yīng)的過渡步驟，從嚙齒類動物向人體轉(zhuǎn)換將很困難。

2 模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與造模方法

由于病因不同、持續(xù)時(shí)間長短不一、梗死位置的變化、缺血嚴(yán)重程度的差異，以及并發(fā)的其他系統(tǒng)性疾病的不同，造成了中風(fēng)臨床癥狀的多樣性。中風(fēng)臨床表現(xiàn)的多樣性和復(fù)雜性，使得利用實(shí)驗(yàn)動物或細(xì)胞模型完全模擬人類的中風(fēng)，是非常困難的。建立一個(gè)完全理想的缺血性腦中風(fēng)模型，幾乎是不可能的。因此，選擇動物中風(fēng)模型，最重要的是該模型與中風(fēng)臨床表現(xiàn)的匹配度是多少。應(yīng)該基本符合以下標(biāo)準(zhǔn)［6］:①缺血過程和病理生理反應(yīng)與人類中風(fēng)相似;②缺血性病灶大小重現(xiàn)性強(qiáng);③建模的技術(shù)相對容易的，創(chuàng)傷小;④可以監(jiān)測生理變量，并可維持在正常范圍內(nèi);⑤可方便獲取腦樣品，進(jìn)行病理組織學(xué)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究;⑥費(fèi)用合理。

缺血性中風(fēng)動物模型分為局灶性腦缺血模型和全腦缺血模型兩大類。全腦缺血模型(global ischemia)的組織病理學(xué)和所觀察到的行為障礙顯著不同，重現(xiàn)性差。目前基礎(chǔ)研究中主要采用局灶性腦缺血模型。局灶性腦缺血模型又分為永久性和暫時(shí)性缺血模型兩種。無論是永久性還是暫時(shí)性缺血，缺血性病灶大小差異都很大，而超過3 h的局部腦缺血是不可逆的［7］。這種差異直接影響藥物的評價(jià)結(jié)果。永久中風(fēng)模型用來研究沒有再灌注作用的腦缺血，而暫時(shí)性腦缺血模型的閉塞動脈再灌模型，所產(chǎn)生的后果(即再灌注損傷)非常接近人類中風(fēng)缺血部位再灌注，用于較系統(tǒng)地研究缺血性中風(fēng)發(fā)生后的病理變化、藥物的作用機(jī)理，以及研制開發(fā)新的治療方法，是目前使用最為廣泛的動物模型。

目前局灶性大腦中動脈缺血模型的制備方法包括:①開顱機(jī)械閉塞法;②光化學(xué)誘導(dǎo)血栓形成法;③微栓子栓塞阻斷法;④內(nèi)皮素－1灌注誘導(dǎo)血管收縮法;⑤化學(xué)刺激誘導(dǎo)血栓性閉塞法;⑥血管內(nèi)線栓阻斷法等。其中以血管內(nèi)線栓阻斷法應(yīng)用最為廣泛。無論使用何種動物，采用何種方法，如何減少組間、個(gè)體內(nèi)差異，都是評價(jià)模型成功與否的關(guān)鍵。主要的局灶性腦缺血模型制備方法及其優(yōu)缺點(diǎn)介紹如下:

3 局灶性腦缺血模型

3.1 大腦中動脈電凝阻斷模型

通過將雄性SD大鼠小顱窗暴露大腦中動脈起始部，在大腦中動脈靠近頸內(nèi)動脈處將其電凝阻斷，造成供應(yīng)區(qū)缺血。為常用的永久性局灶性腦缺血模型。缺血成功率高，重復(fù)性好;但手術(shù)較復(fù)雜，且須開顱，破壞了顱腔完整性，如操作不當(dāng)，可直接損傷腦組織。理論上可制成再灌注模型，但實(shí)際操作較困難［8］。

3.2 大腦中動脈線栓法再灌注模型

Koizumi［9］首次描述了線栓法阻塞大鼠大腦中動脈，將尼龍線自雄性SD大鼠的頸外動脈插入，然后將線引入頸內(nèi)動脈，使其穿過大腦中動脈起始部，阻斷大腦中動脈，造成大腦中動脈供應(yīng)區(qū)血流中斷，導(dǎo)致局灶性缺血。缺血一定時(shí)間后，將栓線慢慢抽出，恢復(fù)血流進(jìn)行再灌注。此法誘發(fā)的缺血再灌注和永久性缺血性損傷程度有所差別，永久性缺血后梗死體積較短暫性缺血要大。本法無需開顱避免了手術(shù)操作對腦組織的直接刺激作用。方法簡單易行，適于對再灌注損傷的病理生理機(jī)制研究。目前該法已逐漸取代開顱法而成為最流行的方法。優(yōu)點(diǎn)是無需開顱，屬相對非侵入的方法。缺點(diǎn)是需要一定的手術(shù)技巧，在以往復(fù)雜的操作中常出現(xiàn)動物死亡率高、腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血、梗死大小不衡定等情況。另外個(gè)體差異較大，死亡率高。

Longa［10］和Belayev等［11，12］發(fā)現(xiàn)模型的可重復(fù)性和面積似乎受到許多具體因素影響，如栓線直徑(3.0或4.0線)，栓頭涂層(硅酮或多聚賴氨酸)，栓線插入深度等，與梗死體積和神經(jīng)功能評分直接相關(guān)，并對Koizumi的制備方法進(jìn)行了改進(jìn)。目前多數(shù)文獻(xiàn)中，采用Longa提出的MCAO的制備方法。因此，尋找一種內(nèi)在性質(zhì)均一，具有一定硬度和彈性的栓線，是進(jìn)一步提高線栓法大鼠MCA局灶性腦缺血模型成功率的關(guān)鍵。

線栓法不利之處包括:①血管破裂和隨后蛛網(wǎng)膜下腔出血;②體溫過高;③不適當(dāng)?shù)拇竽X中動脈阻塞。栓線的有機(jī)硅涂層和激光多普勒引導(dǎo)下插線可以減少蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生。自發(fā)高熱的產(chǎn)生，被認(rèn)為發(fā)生在大多數(shù)動物大腦中動脈阻塞持續(xù)2h或更長時(shí)間，是與下丘腦損傷有關(guān)。

我們在Longa法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，使得制作方法簡便，提高了造模的成功率和可重復(fù)性，制成穩(wěn)定均一的MCAO模型［13］。具體方法為大鼠麻醉后，分離頸總動脈(CCA)和頸外動脈(ECA)，將鼠頭沿長軸方向扭轉(zhuǎn)向左側(cè)45°，拉直ECA與頸內(nèi)動脈(ICA)的夾角。使用頭端3 mm硅膠包埋制成0.26～0.3 mm膨大的線栓，插入自CCA與ICA分叉點(diǎn)18 mm。術(shù)后2 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分，均為2分，造模均一性好;術(shù)后20 h行TTC染色，示大鼠大腦中動脈(MCA)皮層分布區(qū)產(chǎn)生梗死灶，梗死比為(19.066±1.556)%，水腫比為(1.031±0.024)。造模成功率為93.75%，死亡率為6.25%(2/30，尸檢結(jié)果顯示蛛網(wǎng)膜下腔出血)。

線栓法MCAO模型的制備方法，也適用于小鼠［14，15］，如轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠突變體［16］;Kong等［17］在非鼠動物也成功地制備了MCAO模型，如兔;另外探討非人靈長類動物的MCAO模型的制備方法也十分需要。

3.3 光化學(xué)法誘導(dǎo)模型

本法通過將光敏染料孟加拉紅經(jīng)尾靜脈注入后，采用特定光波在顱骨表面做定向照射，形成大腦皮質(zhì)區(qū)梗死［18］。注入體內(nèi)的光敏染料在特定光波的作用下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，引起內(nèi)皮細(xì)胞過氧化，釋放自由基，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，誘發(fā)血小板聚集而形成血栓。用該法后梗死部位可任選，不限于大腦中動脈供血區(qū);操作方便、重復(fù)性好;該模型適于研究抗血小板藥、抗血栓藥及內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)劑。但其造成永久性閉塞，無法再灌注。此模型創(chuàng)傷小，動物存活率高，梗死部位及大小易于控制，適合老年卒中患者相關(guān)基因及干預(yù)治療的研究。

3.4 局灶血栓注入法

1982年Kudu等［19］將血凝塊分段并注入頸內(nèi)動脈，不僅導(dǎo)致了顱內(nèi)栓塞，而且也引起了顱外栓塞。這可能是由于血凝塊彌散到作為頸內(nèi)動脈主要分支的翼突腭動脈所引起。為防止顱外栓塞，Overguarll等［20］對該模型進(jìn)行了改良，結(jié)扎了翼突腭動脈、甲狀腺動脈、枕骨動脈，將血凝塊注入頸總動脈，但這些步驟并不能防止對側(cè)半球栓塞，因?yàn)槟獕K可通過Wills環(huán)到對側(cè)半球。血栓栓塞性中風(fēng)模型比其他腦缺血模型更接近人類中風(fēng)，大多數(shù)的人類中風(fēng)是血栓栓塞引起的。另外，血栓模型具有測試溶栓劑的潛力，可更好地評估經(jīng)歷了溶栓的缺血性病變，為研究聯(lián)合療法提供了可能，如溶栓劑和神經(jīng)保護(hù)藥物［21］。血栓栓塞缺血的誘導(dǎo)最常見的是由自體血栓進(jìn)入到顱外動脈達(dá)到更遠(yuǎn)端顱內(nèi)動脈。在早期血栓模型，人體血液凝塊，或懸浮的同源小血塊碎片被用來產(chǎn)生栓塞。

Wang等［22］改良了微栓子栓塞阻斷法，他們將導(dǎo)管插入頸內(nèi)動脈，將不同容積的凝血酶注入微導(dǎo)管，在導(dǎo)管內(nèi)制備血凝塊，然后將血凝塊注入頸總動脈，阻塞MCA，誘導(dǎo)產(chǎn)生不同體積的大腦缺血性損傷。這種方法不僅使外科手術(shù)步驟更為簡便，而且與臨床局灶性腦缺血更為接近。因?yàn)榕R床上大多數(shù)患者在單純腦中風(fēng)事件中很少有大腦血栓栓塞伴兩側(cè)頸總動脈阻塞。這種栓塞性腦梗死模型成功率高，手術(shù)創(chuàng)傷較小，但也存在不能控制再通、對側(cè)亦可能受累以及可能導(dǎo)致外源物質(zhì)引起的炎癥反應(yīng)等缺點(diǎn)。凝塊狀血栓栓子技術(shù)，用大腦中動脈中血小板自然形成的凝塊或者中動脈中凝血酶形成的凝塊可直接模擬人體中凝塊誘導(dǎo)的腦缺血。但由于栓子的隨機(jī)性，無法預(yù)測栓塞的部位和大小，側(cè)支循環(huán)的影響使組織缺血程度不一，不利于神經(jīng)癥狀觀察和組織定量分析。

綜上所述，隨著實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)的不斷發(fā)展，對腦缺血動物模型從動物的選擇、模型的分類及制備方法等角度進(jìn)行了多方面的探索。核心是強(qiáng)調(diào)缺血損傷的可控性和重現(xiàn)性，同時(shí)嚴(yán)格控制各種干擾因素，盡量避免其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響?？傮w發(fā)展趨勢一是基礎(chǔ)研究中的動物小型化，基于簡便廉驗(yàn)的考慮，主要以嚙齒類尤其是大鼠為主，近年來由于轉(zhuǎn)基因小鼠的出現(xiàn)，也需要對小鼠的各種腦缺血模型進(jìn)行研究;另一趨勢是在基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用研究的過渡中，基于最大臨床模擬度的考慮，越來越需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的、被廣泛接受的非人靈長類腦缺血動物模型。總之各種腦缺血模型都有自己的優(yōu)點(diǎn)與局限性，在研究中應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的情況選用最適合的方法，還需要對其進(jìn)行改進(jìn)，建立最利于研究的模型。

［1］Stroke Therapy Academic Industry Roundtable(STAIR).Recommendations for standards regarding preclinical neuroprotective and restorative drug development［J］.Stroke，1999，30:2752－2758.

［2］張利能，李樹清.銀杏內(nèi)酯B改善樹鼩血栓性腦缺血半暗區(qū)rCBF及離子穩(wěn)態(tài)機(jī)制的探討［J］.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，3 (3):85.

［3］Macrae I.New models of focal cerebral ischemia［J］.Br J Clin Pharmacol，1992，34:302－308.

［4］Takizawa S，Hogan M，Hakim AM.The effects of a competitive NMDA receptor antagonist(CGS－19755)on cerebral blood flow and pH in focal ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1991，11:786－793.

［5］Brinker G，F(xiàn)ranke C，Hoehn M，et al.Thrombolysis of cerebral clot embolism in rat:effect of treatment delay［J］.Neuroreport，1999，10:3269－3272.

［6］Li F，F(xiàn)isher M.Animal modeling for developing stroke therapy. In:Fisher M(Ed.)Stroke therapy［M］.Woburn，MA:Butterworth－Heinemann，2001，83－96.

［7］Grotta J.Stroke treatment in the human versus animal models. In:Ginsberg MD，Bogousslavsky J(ed.).Cerebrovascular disease:pathophysiology，diagnosis，and management［M］.Blackwell Scientific Publications，1998，1901－1906.

［8］Wang LC，F(xiàn)utrel N，Wang DZ et al.A reproducible model of middle cerebral infarcts compatible with long term survival in aged rats［J］.Stroke，1995，26:2087－2090.

［9］Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al.Experimental studies of ischemia brain edema:A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemia area［J］.Jpn J Stroke，1986，8:l－8.

［10］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84–91.

［11］Belayev L，Alonso OF，Busto R，et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture.Neurological and pathological evaluation of an improved model［J］.Stroke，1996a，27:1616－1622.

［12］Belayev L，Busto R，Zhao W，et al.Quantitative evaluation of blood brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Brain Res 1996b，739:88－96.

［13］謝婷，趙琰，屈會化，等.一種新的線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血模型方法［J］.實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)，2008，28(2):80－84

［14］Hata R，Mies G，Wiessner C，et al.A reproducible model of middle cerebral artery occlusion in mice:hemodynamic，biochemical，and magnetic resonance imaging［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1998，18:367－375.

［15］Li J，Henman MC，Doyle KM，et al.The preischaemic neuroprotective effect of a novel polyamine antagonist，N1－dansylspermine in a permanent focal cerebral ischaemia model in mice［J］.Brain Res，2004，1029:84－92.

［16］Tureyen K，Vemuganti R，Sailor KA，et al.Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice［J］.Neurosurgery 2005，56:196－200.

［17］Kong LQ，Xie JX，Han HB，et al.Improvements in the intraluminal thread technique to induce focal cerebral ischaemia in rabbits［J］.J Neurosci Methods，2004，137:315－319.

［18］李紅戈，張茂悅，童萼塘，等.光化學(xué)誘導(dǎo)大鼠腦皮質(zhì)梗塞模型的研究［J］.卒中與神經(jīng)疾病，1996，3(3):126.

［19］Kudu M，Aoyama A，Iehimori S，et al.An animal model of cerebral infarction:homologous blood clot emboli in rats［J］. Stroke，1982，13(4):505－508.

［20］Overguarll Sereghy T，Boysen G，et al.A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1992，l2(3):484－490.

［21］Zhang L，Zhang ZG，Zhang C，et al.Intravenous administration of a GPIIb/IIIa receptor antagonist extends the therapeutic window of intraarterial tenecteplase－tissue plasminogen activator in a rat stroke model［J］.Stroke，2004，35:2890－2895.

［22］Wang CX，Yaag Y，Yang T，et al.A focal embolic model of cerebral ischemia in rat:introduction and evaluation［J］.Brain Res Protocols，2001，(7):115－200.

Current Status of Research on Animal M odels of Experimental Ischem ic Stroke

QU Hui－h(huán)ua，ZHAO Yan，LU Jian－qiu，WANG Qing－guo
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

It is of great importance to use animal models in research on human diseases.However，it is very difficult to establish laboratory animal models perfectly duplicating human diseases such as cerebral stroke.Thus the high similarity of animal models to clinical status is of great importance.In order to refer to more appropriate experimental animal model for basic and applied research of ischemic stroke，this article summarized research progress in research on experimental ischemic stroke models and reviewed the animal selection，evaluating standard，modeling method，major advantages and disadvantages of focal ischemic models.

Ischemic Stroke;Animal model;MCAO

R－33

A

1005－4847(2010)04－0360－04

2009－10－12

國家自然基金重大研究計(jì)劃面上項(xiàng)目(編號:90709051);國際科技合作項(xiàng)目(編號:2007DFA30730);國家“重大新藥創(chuàng)制”專項(xiàng)課題(編號:2009ZX09102－126)。

屈會化(1966－)，男，博士，研究方向:實(shí)驗(yàn)動物模型。E－mail:zhaoyandr@gmail.com

王慶國。E－mail:wangqg8558@sina.com