李 宜，胡元會，齊連芬，王師菡，石 潔，褚瑜光

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院，北京 100700；

2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 心血管內(nèi)科，北京 100053；

3.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 功能科，北京 100053）

2

目前，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度對機(jī)體生命活動中某一生理或病理過程進(jìn)行研究已成為熱點(diǎn)。高血壓病屬中醫(yī)學(xué)“頭痛”、“眩暈”等范疇，中醫(yī)藥治療高血壓病有著廣闊的研究前景，不僅能有效降低血壓水平，還極大地改善患者的生存質(zhì)量，降低患者并發(fā)癥的發(fā)生。連萸降壓膠囊主要成分是黃連素、吳茱萸次堿，2種成分合用降壓平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)采用雙向凝膠電泳分離連萸降壓膠囊干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠后的血清蛋白質(zhì)，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度探討連萸降壓膠囊的降血壓機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 12周齡SHR（清潔Ⅱ級）20只，雌雄各半，購自北京維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（動物合格許可編號 SCXK（京）2007-0001）。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 Ettan IPG-phor3等電聚焦儀（GE Healhcare，USA）；Ettan DALT3 System垂直電泳（Bio-Rad，USA）；ImageScanner光密度掃描儀（Amersham pharmacia，USA）；UA-16A分光光度計(jì)（Shimadzu corporation，Japan）；Imagemaster凝膠圖像分析軟件（Amersham Pharmacia Biotech，USA）；Auto-REFLEXTMⅢ型基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Bruker cooperation USA）；Speed Vac真空冷凍干燥離心機(jī)（Thermo Savant USA）。

1.1.3 主要藥品 連萸降壓膠囊：黃連素，兗州大禹制藥有限責(zé)任公司，批號國藥準(zhǔn)字040709；吳茱萸次堿，西安冠宇生物技術(shù)有限公司，批號Evo070503。兩藥以3∶1比例加入0.9％生理鹽水配成溶液（黃連素240mg/kg+吳茱萸次堿80mg/kg的配液法：黃連素14.4g+吳茱萸次堿4.8g加入600ml 0.9％生理鹽水中）。

1.1.4 主要試劑 非線性固相pH梯度干膠條（GE Healhcare pH3～10，18cm）、IPG Buffer（pH 3～10）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、溴酚藍(lán)、過硫酸胺（APS）、甘氨酸、丙烯酰胺、IPG-Buffer、覆蓋液、瓊脂糖、尿素（Urea）、考馬斯亮藍(lán) R-350、標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)志物購自 A-Pharmacia公司，三氟乙酸（TFA）、N′-甲叉雙丙烯酰胺、CHAPS購自Sigma公司，無水醋酸鈉、無水碳酸鈉、硝酸銀、硫代硫酸鈉、戊二醛、乙醇、冰醋酸、甲醇、乙腈、甘油、甲醛、1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）、碳酸氫氨（NH4HCO3）、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純或色譜純。水為MilliQ超純水、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮-胰蛋白酶（TPCK-TryPsin）、三氟乙酸（TFA）、乙睛（ACN）、基質(zhì) a-氰基-4-羥基肉桂酸（CCA）等均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 選取12周齡的SHR 20只，體質(zhì)量203g～358g，隨機(jī)數(shù)法分為模型組，中藥組每組共10只，雌雄各半。模型組：給予0.9％生理鹽水10ml/（kg·d）灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃4周；中藥組：按黃連素240mg/（kg·d）+吳茱萸次堿80mg/（kg·d）的劑量配制混懸液，以10ml/（kg·d）灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃4周。

1.2.2 血清的制備 第4周末，所有大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于大鼠手術(shù)臺上，頸部去毛，碘伏消毒皮膚，剪開頸前部皮膚，分離肌肉，暴露左頸動脈，自頸外動脈抽取動脈血，放入空白試管，混勻低溫離心（3000r/min，4℃），離心機(jī)半徑180mm，離心10 min，取上清液，所有樣本均于－86℃低溫冰箱中保存。每組隨機(jī)各取5份樣品血清，準(zhǔn)備蛋白質(zhì)組學(xué)分析。使用時(shí)先離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心5 min，采用 Bradford法測定血清蛋白濃度。

1.2.3 雙向凝膠電泳 模型組、中藥組，每組隨機(jī)各取5份樣品進(jìn)行電泳，第一向按IPGphor等電聚焦系統(tǒng)操作指南進(jìn)行，電泳參數(shù)如下：溫度20℃，最大電流 －50μA，電壓（V）：30～11h；500～1h；1000～1 h；8000～10 h；合計(jì) 23h。在 Ettan DALT3 System垂直電泳槽內(nèi)進(jìn)行第二向。電泳條件：恒流40mA 40min、60mA 5h，直至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)玻璃板底部停止電泳（約5～7h）。銀染色后獲得凝膠圖譜。

1.2.4 凝膠圖像分析 采用Image Scanner掃描儀進(jìn)行掃描并獲取圖像。以Imagemaster分析軟件對其進(jìn)行圖像分析。差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的選擇：有2倍以上差異表達(dá)（表達(dá)上調(diào)或下調(diào)）。

1.2.5 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析 凝膠考染后，選取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，經(jīng)水洗、脫色處理后，獲得蛋白質(zhì)肽混合樣品。用 Burker公司REFLEXTMⅢ型 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀進(jìn)行分析：線性模式，正離子譜測定，加速電壓20KV，反射電壓為23KV，質(zhì)譜信號單次掃描累加50次?；|(zhì)用CCA，以基質(zhì)峰和胰蛋白酶自動降解離子峰作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。

1.2.6 數(shù)據(jù)庫查詢 獲得的PMF圖譜用Mascot軟件識別單同位素信號峰，獲得肽片段的質(zhì)荷比（M/Z），Mascot查詢系統(tǒng)（http://www.matrixscience.co.uk）進(jìn)行檢索。搜索數(shù)據(jù)庫為NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。檢索參數(shù)設(shè)置為：

Database-NCBInr， Taxonomy-Rattus， Enzyme-Trypsin， Allow up to-1， Variable modifications-Carbamidonethyl（C）和 Oxidation（M），Peptide tol. ±（0.3）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組之間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠血清蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳（2-DE）圖譜

以18cm非線性IPG膠條對血清蛋白進(jìn)行2-DE，銀染后圖像分析，蛋白點(diǎn)分布清晰，在相同條件下對模型組、中藥組的血清總蛋白，每組各5份樣品進(jìn)行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)5次雙向電泳圖譜非常相似，分別將其中的一塊有大量分辨率高、質(zhì)量好的蛋白質(zhì)點(diǎn)膠定為參考膠，進(jìn)行5塊膠間的蛋白質(zhì)點(diǎn)的匹配，蛋白點(diǎn)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后輸出數(shù)據(jù)到 Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組內(nèi)平均匹配率分別76％、74％，樣品重復(fù)性好，制備穩(wěn)定。模型組、中藥組的血清雙向電泳凝膠上的平均蛋白點(diǎn)分別為：476±30、504±45個(gè)。組間平均匹配率65％，可用于差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的分析。

2.2 2組差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)局部圖譜

分析2組圖譜，連萸降壓膠囊干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠后，有22個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，表達(dá)增強(qiáng)的15個(gè)，表達(dá)降低的4個(gè)，新增加蛋白點(diǎn)3個(gè)。

2.3 質(zhì)譜分析及鑒定結(jié)果

22個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中，共鑒定出10個(gè)蛋白點(diǎn)，另外的蛋白質(zhì)點(diǎn)，由于沒有得到令人滿意的肽質(zhì)量指紋圖譜或搜索數(shù)據(jù)庫時(shí)不能得到可信度較高的結(jié)果而未能鑒定。鑒定出的10個(gè)蛋白質(zhì)為視黃醇結(jié)合蛋白、E3泛素連接酶、線粒體膜蛋白、鋅指蛋白、T細(xì)胞受體、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白 A-鏈、Rho GTPase、methyltransferase，UbiE/COQ5 family、2 個(gè)假想蛋白。

3 討論

高血壓病是臨床常見病、多發(fā)病，隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，高血壓病的發(fā)生率較10年前明顯增加［1］且目前沒有一種特效抗高血壓的西藥可以治愈高血壓或完全逆轉(zhuǎn)或預(yù)防與高血壓相關(guān)靶器官的病理改變［2］。中醫(yī)藥治療高血壓病療效確切，改善癥狀明顯，可以同時(shí)兼顧高血壓并發(fā)癥和伴隨的其他危險(xiǎn)因素的治療。

本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠為觀察對象，通過蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)研究，連萸降壓膠囊干預(yù)后的自發(fā)性高血壓大鼠血清蛋白質(zhì)的不同表達(dá)，成功構(gòu)建2組血清蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜。雙向凝膠電泳（2-DE）是目前蛋白質(zhì)組學(xué)中用于分離蛋白質(zhì)最廣泛的一種方法。同時(shí)2-DE也存在對大分子、疏水蛋白以及極酸極堿蛋白質(zhì)較難分離的缺點(diǎn)［3］。

連萸降壓膠囊干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠后，新出現(xiàn)的蛋白質(zhì)鑒定為E3泛素連接酶和甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，UbiE/COQ5 family）。E3泛素連接酶負(fù)責(zé)確定蛋白質(zhì)泛素化的特異性，識別靶蛋白底物，在蛋白酶體降解蛋白質(zhì)的過程中起極其重要的作用［4］。蛋白質(zhì)的泛素化作為真核生物蛋白質(zhì)降解的重要機(jī)制，對許多重要的生物進(jìn)程如細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等是至關(guān)重要的［5］。甲基結(jié)合生物胺類在體內(nèi)與甲基結(jié)合的反應(yīng)，也稱甲基化。甲基來自蛋氨酸，蛋氨酸的甲基經(jīng)ATP活化成為S-腺苷蛋氨酸，再經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶催化，使生物胺類與甲基結(jié)合而被解毒排泄，甲基轉(zhuǎn)移酶屬于催化底物之間進(jìn)行某些基團(tuán)的轉(zhuǎn)移或交換的酶類，酶只對具有特定空間結(jié)構(gòu)的某種底物起作用。Rho家族蛋白與血管狹窄發(fā)生過程中血管平滑肌細(xì)胞的遷移密切相關(guān)。GTPase介導(dǎo)的小分子蛋白和細(xì)胞遷移密切相關(guān)，阻斷Rho可減少血管平滑肌細(xì)胞遷移［6］。血清視黃醇結(jié)合蛋白是2005年 YangQ等［7］鑒定出的一種新的脂肪因子，血清視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）水平與血壓呈正相關(guān)，既往研究提示，血清RBP4水平與肥胖、胰島素抵抗等的發(fā)生有關(guān)，而胰島素抵抗與高血壓的發(fā)生、發(fā)展都有密切的關(guān)系。

綜上所述，鑒定出的這些蛋白質(zhì)與連萸降壓膠囊的降血壓和改善癥狀密切相關(guān)，可能是連萸降壓膠囊治療作用的靶點(diǎn)。有關(guān)這些顯著變化的蛋白質(zhì)的性質(zhì)、功能及相互關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)得到中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心的王鴻麗、趙永強(qiáng)、薛艷等老師的大力協(xié)助，在此表示衷心的感謝!）

［1］劉忠仁.我國各地高血壓流行病學(xué)調(diào)查近況［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2004，10（2）：88-89.

［2］Chobanian AV，Bakris GL，Black HR，et al.The seventh report of the Joint National Committee on prevention，detection，evaluation，and treatment of high blood pressure：the JNC 7 report［J］.JAMA，2003，289（19）：2560-2572.

［3］LOPEZJ L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis［J］.JChromatogr B Analyt Tehnol Biomed Life Sci，2007，849（1-2）：190-202.

［4］Ciechanover A，Orian A，Schwartz A L.The ubiquitin-mediated proteolytic pathway：mode of action and clinical implications［J］.J Cell Biochem，2000，77（S34）：40-51.

［5］Weissman A M.Themes and variations on ubiquitylation［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（3）：169-178.

［6］Seasholtz TM，Majumdar M，Kaplan D，et al.RHO and RHO kinase mediate thrombin-stimulated VSMC DNA synthesis and gration［J］.Circulation，1999，84：1186-1193.

［7］Yang Q，GrahamTE，ModyN，et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes［J］.Nature，2005，436：356-362.