張大丙

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京海淀 100193）

鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要傳染病。近兩年來,國內外對該病病原開展了分子生物學研究,本文描述了病原的血清型、分類地位、基因組結構、基因組變異性等方面的研究進展。

1 血清型及分類地位

鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV）是鴨病毒性肝炎的致病病原[1],歷史上被分為3個血清型(1～3型）,最初均被假定為小 RNA病毒科成員[2-3]。按國際病毒分類委員會(ICTV）第八次分類報告,血清1型(DHV-1）和3型(DHV-3）屬于小RNA病毒科的2個病毒種[4],而血清2型(DHV-2）屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬的成員,并已被改稱為鴨星狀病毒1型(duck astrovirus 1,DA stV-1）[5]。最近的結果表明,傳統的血清2型和3型均屬星狀病毒[6],應從DHV的血清型中排除。

2007年,研究者分別在臺灣和韓國鑒定出DHV的新血清型,暫稱之為“臺灣新型”和“韓國新型”,2個新型之間的血清學關系尚不清楚,但它們均不與DHV-1產生交叉中和反應[7-8]。DHV-1、“臺灣新型”和“韓國新型”三者之間在衣殼蛋白編碼區(qū)存在較高的變異性(28%～32%的P1核苷酸序列差異和21%～27%的P1氨基酸序列差異）[9],據此可認為它們屬于不同的血清型。

血清1型[10-12]、“臺灣新型”[7]和“韓國新型”[8]DHV均具有典型的小RNA病毒基因組結構,但它們與小RNA病毒科9個已知屬病毒之間的衣殼蛋白以及保守的2C和3D蛋白的氨基酸序列同源性均小于40%,應被歸屬于小RNA病毒科的一個新屬,ICTV小RNA病毒研究組建議稱之為禽肝病毒屬(avihepatovirus）(http://www.picornaviridae.com）。

按照現有的知識可認為,鴨病毒性肝炎可由小RNA病毒科禽肝病毒屬鴨肝炎病毒的3個型和星狀病毒科禽星狀病毒屬的2種鴨星狀病毒引起,故在描述該病病原時易出現混淆:(1）作為星狀病毒[6],DHV-3仍在使用[4]。(2）在ICTV第八次報告中,DHV-1是一個病毒種[4],但DHV-1通常又指DHV的血清1型;當出現新的血清型時(如“臺灣新型”和“韓國新型”）,傳統的血清1型和新的血清型如何稱呼?是將它們稱為DHV的不同血清型還是DHV-1的不同血清型?

為避免混淆,可引入一個新的病毒種名,即鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV）[13],既可與鴨星狀病毒相區(qū)分,亦可與鴨乙肝病毒相對應,還便于對該病毒的不同血清型進行命名。因此,作為鴨病毒性肝炎的病原之一,DHAV特指小 RNA病毒科禽肝病毒屬的成員。可用DHAV-1代表傳統的血清1型,如果血清學試驗結果最終表明“臺灣新型”和“韓國新型”缺乏血清學相關性,則分別稱之為血清2型(DHAV-2）和血清3型(DHAV-3）[13]。進化分析中,血清1型、“臺灣新型”和“韓國新型”分屬3個不同的基因型,即 A型(DHAV-A）、B型(DHAV-B）和 C型(DHAV-C）[9]。目前,分子生物學技術的運用日益廣泛,若用基因型描述DHAV不同毒株的型別更為方便。

2 基因組結構

DHAV有小RNA病毒的基因組基本結構,即僅含一個大的 ORF,其兩側分別是 5′UTR和3′UTR,3′UTR 之后是poly(A）尾。ORF編碼一個聚蛋白,從 N端到C端方向,分別為結構蛋白區(qū)(P1）和兩個非結構蛋白區(qū)(P2和P3）。預測P1區(qū)裂解為3種衣殼蛋白(VP0、VP3和VP1）,P2區(qū)裂解為4種或5種非結構蛋白(2A 1、2A 2或2A 2+2A 3、2B和2C）,P3區(qū)裂解為4種非結構蛋白(3A、3B、3C和3D）[7-8,10-12]。與多數小 RNA病毒相比,DHAV的基因組有其自身的結構特點,例如VP0缺乏成熟切割、含有不同2A蛋白的組合、擁有小RNA病毒科中最長的 3′UTR。不同研究者對IRES的類型、L蛋白的有無和2A蛋白的數量等3個方面的分析結果尚未取得一致的意見。

小RNA病毒的5′UTR至少存在兩個功能域,其5′端與病毒RNA的復制有關,3′端則含有與起始蛋白質翻譯有關的IRES。目前,在小RNA病毒中發(fā)現了4種不同類型的IRES。腸道病毒和鼻病毒的IRES屬于Ⅰ型,口蹄疫病毒、心病毒、人雙?？虏《?human parechovirus,HPeV）和ljungan病毒(ljungan virus,LV）的IRES屬于Ⅱ型,甲肝病毒的IRES屬于Ⅲ型,而豬捷申病毒Ⅰ型(porcine teschovirus 1,PTV-1）與黃病毒科丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV）相似,其IRES屬于Ⅳ型。Kim MC等(2006）、Tseng C H 等(2007）和 Tseng C H和Tsai H J(2007）認為:DHAV可能與 LV和HPeV類似,擁有Ⅱ型IRES[7,11-12]。但Ding C和Zhang D(2007）則認為:DHAV的IRES可能屬于Ⅳ型 。其原因是:在DHAV 的 5′UTR 中,存在非典型的 Yn-Xm-AUG基序(Y5-X5-AUG或 Y 7-X71-AUG）,并不符合 Ⅱ型 IRES的特征。比較5′UTR的序列可以發(fā)現,對應于Ⅳ型IRES中構成Ⅲe域的區(qū)域,DHAV和HCV的12個堿基完全一致,而DHAV與PTV-1的12個堿基僅存在一個堿基的差異。同時,對應于Ⅳ型IRESⅢe域的下游序列及Ⅲ域的上游序列,DHAV的5′UTR序列亦可以互補配對形成一個類似于HCV和PTV-1Ⅲf域的假結[10]。

Kim MC 等(2006）、Tseng C H 等(2007）、Tseng C H和Tsai H J(2007）和Kim MC等(2007）認為,DHAV基因組ORF的5′端不編碼L蛋白[7-8,11-12],但分析結果顯示,所有DHAV毒株聚蛋白N端的31-35均為GA/VVES序列,與其他小RNA病毒VP0/VP4蛋白N端的豆寇酰化信號序列(GxxxS/T）相符,因此,Ding C和 Zhang D(2007）預測在DHAV的N端存在一個短的L蛋白,含30個氨基酸[10]。

和LV類似,DHAV的2A蛋白由結構上不同的蛋白組成。Kim MC等(2006）、Ding C和Zhang D(2007）認為,DHAV的2A蛋白是由20個氨基酸的口蹄疫病毒樣2A 1與285個氨基酸的人雙?？虏《緲?A 2組成,在2A 2的N端存在一個AIG1保守域[10-11]。和LV的2A 2蛋白相比,DHAV的2A 2蛋白在N端長出161個氨基酸,Tseng C H等(2007）、Tseng C H 和 TsaiH J(2007）認為,這多出的161個氨基酸將會形成一種成熟的蛋白(2A 2）,而剩下的124個氨基酸則形成另外一種成熟蛋白(2A 3）[7,12]。

3 變異性

根據衣殼蛋白編碼區(qū)的序列同源性和進化分析的結果,可將DHAV區(qū)分為3個基因型,Wang L等(2008）稱之為A型(DHAV-A）、B型(DHAV-B）和C型(DHAV-C）[9]。在VP1區(qū),型內核苷酸和氨基酸序列同源性分別≥90%和92%,型間核苷酸和氨基酸序列同源性分別≤72%和79%;在VP0區(qū),型內核苷酸和氨基酸序列同源性分別≥92%和96%,型間核苷酸和氨基酸序列同源性分別≤73%和81%;在VP3區(qū),型內核苷酸和氨基酸序列同源性分別≥91%和95%,型間核苷酸和氨基酸序列同源性分別≤74%和83%。說明DHAV的衣殼蛋白編碼區(qū)序列在型內高度保守,在型內具有較高的變異性。

在非結構蛋白編碼區(qū),型內序列亦高度保守(核苷酸和氨基酸序列同源性分別≥91%和94%）,型間情況則有所不同。在核苷酸水平,型間各非結構蛋白編碼區(qū)的序列變異性均較高(同源性為67%～85%）;在氨基酸水平,DHAV-B和DHAV-C之間各非結構蛋白的序列均較保守(同源性為90%～97%）,但比較這兩個基因型與DHAV-A之間的關系,可見2A和3AB蛋白的氨基酸序列變異性較高(同源性為 70%～77%）,而 2B、2C、3C和 3D蛋白的氨基酸序列則較為保守(同源性為86%～93%）。

兩個非翻譯區(qū)的核苷酸序列在型內亦高度保守(序列同源性≥93%）。在型間,5′UTR序列高度變異(序列同源性為 69%～74%）,對于 3′UTR,DHAV-B和DHAV-C之間較為保守(序列同源性為89%～92%）,但它們與DHAV-A之間均表現出較高的變異性(序列同源性為63%～70%）。

3個型DHAV在基因組長度亦表現出差異。不計poly(A）尾,DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C的基因組長度分別為7 689-7 691 nt、7 769 nt和7 773～7 775 nt。不同基因型DHAV基因組長度差異源于3個基因區(qū):VP1、5′UTR和3′UTR。

DHAV-A和DHAV-B的VP1長714 nt,編碼238個氨基酸的 VP1蛋白[7,10-12],而 DHAV-C的VP1長720 nt,編碼240個氨基酸的VP1蛋白[8]。因此,DHAV-C的ORF(6 756 nt）比DHAV-A和DHAV-B的ORF(6 750 nt）長6個堿基,編碼的聚蛋白(2 251 aa）比DHAV-A和DHAV-B的聚蛋白(2 249 aa）多2個氨基酸。

不同基因型之間,5′UTR和3′UTR中存在廣泛的插入/缺失,相對于 DHAV-A,DHAV-B和DHAV-C的兩個非翻譯區(qū)更長,而 DHAV-B和DHAV-C的兩個非翻譯區(qū)的長度相似。DHAV-A的5′UTR 和 3′UTR 分別長 625-626 nt和 314-315 nt[10-12],DHAV-B的5′UTR 和3′UTR 分別長653 nt和 366 nt[7],而 DHAV-C 的 5′UTR 和3′UTR的長度分別為651-652 nt和366-367 nt。

4 展望

DHAV分子生物學研究工作的開展對于確定該病毒的分類地位,進一步研究該病毒的分子致病機制奠定了良好的基礎。DHAV的基因組序列特點則有利于建立快速的分子檢測和分型方法?；?′UTR部分序列的分析結果,已確定我國多個地區(qū)同時流行DHAV-A和DHAV-C[13]。進一步開展DHAV的分子流行病學研究可較全面的掌握我國DHAV的血清型/基因型分布,其結果對于有效控制我國鴨病毒性肝炎的發(fā)生和流行具有重要意義。

[1] Levine P P,Fabricant J.A hitherto-undescribed virus disease of ducks in North America[J].Cornell Vet,1950,40:71-86.

[2] Asplin F D.Duck hepatitis.Vaccination against tw o serological types[J].Vet Rec,1965,77:1529-1530.

[3] H aider S A,Calnek BW.In-vitro isolation,propagation and characterisation of duck hepatitis virus typeⅢ[J].Avian Dis,1979,23:715-729.

[4] Fauquet C M,Mayo A,Maniloff J,et a l.V irus Taxonomy[M]//Eighth Report of the InternationalComm ittee on Taxonomy of Viruses.Calif:Elsevier Academ ic Press,2005:757-778.

[5] Fauquet C M,Mayo A,Maniloff J,et a l.V irus Taxonomy[M]//Eighth Report of the International Comm ittee on Taxonomy of Viruses.Calif:Elsevier Academ ic Press,2005:859-864.

[6] Todd D,Smyth V J,BallNW,eta l.Iden tification of chicken en terovirus-like viruses,duck hepatitis virus(DHV）type 2 and DHV type 3 asastroviruses[J].Avian Pathol,2009,38:21-30.

[7] Tseng C H,Tsai H J.Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J].Virus Res,2007,126:19-31.

[8] K im MC,Kw on Y K,Joh S J,etal.2007.Recent Korean isolates of du ck hepatitis virus revealed the presence of a new geno-and serotypew hen compared to duck hepatitis virus type 1 type strains[J].A rch Virol,2007,152:2059-2072.

[9] Wang L,Pan M,Fu Y,eta l.Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis[J].V irus Genes,2008,37:52-59.

[10]Ding C,Zhang D.Molecular analysisof du ck hepatitis virus 1[J].Virology,2007,361:9-17.

[11]Kim MC,Kwon Y K,Joh S J,et al.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 reveals a novel lineage c lose to the genus Parechovirus in the fam ily Picornaviridae[J].J Gen V irol,2006,87:3307-3316.

[12]Tseng C H,Know les N J,Tsai H J.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus[J].Virus Res,2007,123:190-203.

[13]Fu Y,Pan M,W ang X,et al.Molecu lar detection and typing of duck hepatitis A virus directly from clinical specimens[J].Vet Microbiol,2008,131:247-257.