李媛媛 劉玉新 竺亞斌 陳 玲 俞珺瑤

（寧波大學醫(yī)學院，寧波 315211）

引言

在面對目前食道癌手術后帶來的多種并發(fā)癥（如吻合口瘺、狹窄、壞死、反流等諸多問題）的情況下，人們希望能夠研制出一種與食道功能與形態(tài)一致的替代物。1993年，組織工程學正式提出以來，研究者們一直在探索用合適的支架材料與食道細胞相結合，構建組織工程化食道。隨著各門學科技術（如生物材料學、生物反應技術及分子生物學等）的發(fā)展，組織工程化食道的研究也不斷取得新的突破，它正朝著制作材料普遍、組織相容性高、創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少等方面發(fā)展，這使其必將在今后的臨床應用上起到重要作用［1］。現將以食道組織工程的一個重要環(huán)節(jié)——支架材料為重點，對目前食道組織工程的研究現狀及發(fā)展趨勢作一綜述。

1 用于構建組織工程化食道支架的基材

支架材料，作為組織臨時基質，不僅為細胞組織提供支撐，在細胞附著、生長、增殖、組織或器官形成等方面起到了支持、引導作用，是組織工程化食道研究的重點和難點。各種不同性質的材料被引入到構建人工食道的研究中，在體外構建食道上皮、肌肉及神經組織，但其相互之間的生理生化作用、組織相容性等方面的問題仍未得到解決。

1.1 天然生物材料

天然生物材料因其普遍存在于生物體內、生物和細胞相容性好等特點，一直受到研究者的關注。運用于組織工程化食道支架材料的天然生物材料，主要包括膠原、殼聚糖、明膠、去細胞外基質等。

Marzaro等將食道平滑肌細胞與同源的小豬食道去細胞化基質體外培養(yǎng)，將其移植在3～4周的小豬食道缺損部位，小豬可以從口腔進食。移植3周后，有炎癥反應，無排斥現象。解剖后，運用免疫組化等實驗，驗證了去細胞支架能夠提供平滑肌細胞支撐、黏附等作用［2］。

Badylak等將來自豬小腸黏膜下層（SIS）或膀胱黏膜去除上皮細胞和肌層，制成天然支架，用于犬的食管修復，發(fā)現食管的黏膜上皮在35d左右覆蓋整個供體，50d后新生血管和肌束形成，2個月內，支架材料被吸收；補片供體未出現狹窄，但管狀供體出現狹窄，管徑縮小約50％［3］。近期，Badylak研究組的Agrawal等將來源于豬的細胞外基質作為支架，在大鼠腹壁培育神經組織，28d支架上發(fā)現成熟、未成熟的神經及施旺細胞，91d在手術后的牛模型中進行食道修復［4］。實驗發(fā)現，細胞外基質構成的生物支架可以用于構建組織，而神經分布在重建組織中是一個具有重要功能的組成部分。Wei等也利用豬小腸黏膜（SIS），將實驗犬口腔上皮細胞體外擴增后，與其形成上皮細胞-SIS復合物。與復合物細胞同源的實驗犬手術造成食道缺損，并將該復合物移植到缺損處［5］。實驗發(fā)現，細胞-SIS復合物實驗組無炎癥反應，支架材料布滿鱗狀上皮細胞，細胞-SIS組上發(fā)現肌肉組織再生。

Isch等用去細胞化皮膚（AlloDerm）對實驗犬進行頸段食管成形術，術后2個月后管壁完全上皮化，無吻合口瘺和狹窄發(fā)生，其作為補片狀修補、作為管狀替代的效果，還未進一步證實［6－7］。Bhrany［8］和Ozeki［9］所在的不同的兩個研究組報道了大鼠模型中食道上皮細胞在去細胞化食道支架上的生長情況；在比較脫氧膽酸和曲拉通100兩種試劑去除細胞的方法后得出結論，認為去細胞化的理想方法是使用脫氧膽酸，對所植上皮細胞的免疫組化研究也證實了上述結論的可靠性。Urita等報道了胃去細胞基質能夠滿足食道黏膜的再生，并且未發(fā)生狹窄和擴張［10］。

Saxena等運用羊的食道上皮細胞和膠原支架構建細胞-支架復合物，對膠原支架材料上生長的羊食道上皮細胞亞群進行研究與分析［11］，結果是廣譜細胞角蛋白（pan cytokeratin，PCK-26）陽性的羊食道上皮細胞亞群適合食道構建及產生。秦雄等在熱交聯(lián)海綿狀膠原蛋白-殼聚糖膜上，培養(yǎng)新生牛食管上皮細胞，后植入裸鼠背闊肌表面，2周后食管上皮細胞分化至10層，4周后膠原蛋白-殼聚糖膜被降解吸收［12］。Saito等的實驗也證明，膠原蛋白-殼聚糖膜可作為組織工程構建可降解人工食道的基質材料［13］。

在上述研究中，天然材料具有一定的細胞相容性，但是在用于食道組織工程支架時，還存在著諸如去細胞外基質來源有限、膠原等天然大分子易降解、機械強度較弱等缺點。

1.2 高分子材料

高分子材料具有來源廣泛、成本低、易造型等特點，很早就被引入到組織工程學研究中。早在1953年，Berman首次應用聚乙烯管構建人工食管進行動物及臨床實驗［14］，雖然其實驗存在諸多問題，但開創(chuàng)了組織工程化的先河。Miki等把膠原蛋白及人鱗狀上皮在聚乙烯支架上體外培養(yǎng)擴增，后縫制成有血管肌瓣的組織工程化食道，進行動物實驗［15］。雖然聚乙烯為非降解材料，不能被機體吸收，不過這些工作為食道組織工程研究開辟了使用高分子材料的新途徑。

聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）合成的微喬（Vicryl），是一種水溶性、組織相容性良好的高分子材料，包被上的膠原蛋白可形成管狀結構，即Vicryl管。1991年，Purushotham等將 Vicryl管用于豬模型試驗中，替換其胸段食道［16］。由于胃酸反流將Vicryl管溶解，發(fā)生嚴重滲漏和縱膈炎。后期采用甲醛交聯(lián)，提高了Vicryl管抗腐蝕的能力，但仍不能避免狹窄的出現。Shinhar等于1998年也使用同樣的方法，構成 Vicryl網重建食道，替換豬頸段食道，雖未出現斷端吻合口瘺，但依然未能解決狹窄的問題［17］。

聚乳酸、聚丙交酯等高分子化合物及其聚合物來源廣泛，具有可降解性，可塑能力強，力學性能較好，與天然大分子物質相結合增強了組織相容性，成為組織工程化食道支架材料研究的熱點。鮑春榮等將犬食道上皮細胞體外擴增后，種植到預涂Ⅳ膠原的聚乳酸-聚乙醇酸［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］三維支架材料上，形成食管上皮-支架復合物，在體外分期終止培養(yǎng)；3天后，體外培養(yǎng)的細胞支架復合物植入細胞來源的同只犬腹腔內，進行體內培養(yǎng)［18］。在對不同時期培養(yǎng)后的復合物進行檢測后，發(fā)現分離培養(yǎng)的犬原代食道上皮細胞呈鋪路石樣，體外可大量擴增，體外及體內可見食道上皮在支架材料上黏附、生長良好，持續(xù)培養(yǎng)可保持食道上皮細胞特性。在犬腹腔內培養(yǎng)4周后，可形成食道黏膜樣組織。竺亞斌等將合成材料（如PLGA、PLLA、PCL、PU）及其共聚物等接枝生物大分子（如層粘連蛋白、膠原蛋白等），比較與食道多種細胞的作用情況，發(fā)現接枝后的這些聚合物基材能有效地促進食道的上皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖和功能分化［19－21］，這進一步說明可降解聚合物作為食道組織工程支架基材的可行性。

1.3 鎳鈦合金

鎳鈦合金目前被廣泛用于骨折等外科手術治療中，被公認為具有良好的生物相容性。例如謝遠才等將鎳鈦合金與硅膠結合，制成了人造食道［22］；梁建輝等也運用相同的方法制成人造食道，并將其植入兩組實驗犬體內。結果顯示，兩組實驗均出現人造食道脫入胃內的現象［23］。而且，鎳鈦合金價格高、不能被人體吸收降解，不符合組織工程學的目的和要求。

2 三維多孔支架的制備

三維支架材料為組織工程化食道組織再生及形狀的形成提供了力學支撐，其多孔的特性使支架材料內部相互貫通，利于營養(yǎng)物質的擴散、細胞長入及組織的血管化。構建組織工程三維多孔支架材料的方法很多，如膜材層壓、纖維粘合、乳液冷凍干燥、三維打?。V）等［24］。目前，應用于食道組織工程三維多孔支架材料的常見方法主要有：鹽粒濾-溶劑蒸發(fā)、熱致相分離、靜電紡絲等。

2.1 鹽粒濾-氣體發(fā)泡法

Benjamin等研究者將大鼠食道上皮細胞培養(yǎng)在合成材料支架和天然材料支架上，比較它們之間的相互作用［25］。其中，合成材料是按不同比例，先把聚乳酸、聚己內酯、聚乳酸共羥基乙酸合成為聚合物，再將聲頻篩篩過的碳酸氫銨鹽（顆粒大小在38～75μm和150～250μm）以25∶1加入到聚合物溶液中，后經干燥、氯仿酒精浸濕、檸檬酸浸沒等步驟使氣體發(fā)泡-鹽粒濾，最終獲得多孔支架材料。研究結論是：大鼠食道上皮在合成材料和天然材料支架上都能黏附、增殖，不過在具有成層和正確的微結構合成材料支架上，缺乏正確形態(tài)的細胞內層。

鹽粒濾-氣體發(fā)泡法存在很多缺點，如鹽顆粒不能完全從合成材料中脫去、溶劑有一定毒性、孔徑偏大等，因此在組織工程化食道構建中未被廣泛使用。

2.2 熱致相分離法

1981年，美國Castro提出一種新的制備聚合物微孔膜的方法——熱致相分離法［26］，具有很多傳統(tǒng)方法不能比擬的優(yōu)點：一是可以控制孔隙率、孔徑；二是采取不同的制膜條件，可以獲得不同結構和形態(tài)的孔；三是制膜所用的原材料來源大大增加，不僅能把傳統(tǒng)的聚合物膜材料制成微孔膜，還可以把結晶性的、帶有強氫鍵作用的一類常溫下沒有溶劑的聚合物制成微孔膜［27］。

竺亞斌等利用熱致相分離法（TIPS），將自制的具有較好彈性的無規(guī)共聚物（L-乳酸-co-己內酯，PLLC）制成具有不對稱孔徑的三維多孔支架。食道上皮細胞培養(yǎng)14 d后，能在上述支架上形成一連續(xù)的上皮細胞層，某些部位甚至多于一層，說明此多孔支架對細胞無毒性，且具有一定的支持上皮細胞生長的作用［28］。進一步模擬食道組織結構，將上皮細胞種植于小孔徑表面，將食道成纖維細胞種植于大孔徑的支架本體內部，獲得了兩種細胞在支架上共生長的體系［29］。在支架材料合成和三維支架與食道細胞復合構建方面，獲得了重要的實驗數據，為組織工程化食道的研究打下了良好的基礎。

2.3 靜電紡絲技術

Formhals首先設計并制備了第一套靜電紡絲加工裝置，申請了第一項關于靜電紡絲加工的專利［30－31］，并在后來幾年內完善了靜電紡絲技術［32－33］，使利用靜電紡絲技術制備納米至微米級長纖維成為可能。根據需求調整操作參數和實驗條件，制備成不同外形的纖維狀聚合物支架材料，其孔隙率和比表面積大、均一性高、孔間連通性好，符合組織工程支架材料的需要，在生物工程領域如制備仿生化和功能化組織工程支架有著廣泛的應用［34－35］。

Leong等運用電紡絲技術，將聚（D，L-乳酸）材料制成納米級多孔纖維支架材料，其纖維平均直徑850nm左右，纖維上每平方微米分布16個左右孔隙，將牛血清蛋白吸附在上述多孔支架材料上［36］。豬食道上皮細胞在纖維上種植10～24 h，結果顯示，電紡絲纖維納米級孔能大大增加培養(yǎng)基中小牛血清蛋白的吸收，同時豬食道上皮細胞的黏附率也顯著提高。研究者從而認為靜電紡絲技術制備的多孔納米支架材料在食道組織工程中能為上皮細胞提供黏附、增殖和分化的表面。

竺亞斌等對靜電紡絲復合纖維的制備及其影響因素進行了探索［37］。將生物相容性良好但機械性能差、降解過快的天然高分子材料（如明膠）與外形和機械性能良好的聚己內酯混合電紡，運用靜電紡絲系統(tǒng)在不同實驗條件下，制備成直徑250～660nm、均勻無珠狀物的多孔纖維膜。該研究使兩種材料的優(yōu)點都得以發(fā)揮，使纖維膜的食道細胞相容性因明膠的存在而有望得到改善。將L-乳酸和己內酯的共聚物電紡絲后進行纖粘連蛋白（Fn）纖維表面接枝，明顯促進了食道上皮細胞的黏附和增殖，培養(yǎng)14d后上皮細胞分泌IV型膠原，顯示上皮細胞仍然保持其生物學功能［38］。這些研究為以后成功構建組織工程化食道，奠定了良好的實驗基礎。

3 組織工程化食道其他方面的研究進展

支架材料研究發(fā)展的同時，與食道組織工程密不可分的許多方面研究也有很大進展，如食道組織工程中種子細胞的研究、機械力學和動力學研究等。

3.1 種子細胞

目前，組織工程化食道構建所需的種子細胞多來自成熟的食道組織細胞，進行傳代培養(yǎng)可以在支架材料上形成食道組織（如上皮、肌層、腺體等），但隨著其傳代數的增加和細胞分化增加，增殖逐漸減少，限制了組織工程化食道的壽命。干細胞，包括胚胎干細胞和組織干細胞，是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下可以分化成多種功能細胞。在組織工程領域，組織干細胞已有廣泛的研究和探索。2004年，Epperly等從小鼠骨髓分離出食道祖細胞，證明其在受輻照的受體小鼠體內定植并分化［39］。從成體細胞轉化獲得的胚胎樣細胞（IPS），具有干細胞的多能分化能力，避免了胚胎干細胞的獲取所涉及到的倫理問題，成為組織工程化食道種子細胞的良好選擇［40－41］。存在于羊水中的羊水干細胞，也是一種多能干細胞，在體外培養(yǎng)和移植體內都具有安全性［42］。

干細胞雖然具備很多適于組織工程種子細胞的優(yōu)點，但來源少、獲得困難，儲藏、定向分化等方面費用高昂，或許只有各項相關學科的高速發(fā)展才能解決上述難題。近些年來，基因組學的發(fā)展、基因圖譜的繪制，使一些研究者將目光集中在轉基因動物上。近10年來，世界各國主要以豬為研究對象，為了克服超急排斥反應，已成功地建立了轉基因豬模型。具有人類基因的轉基因豬，能降低或克服異種細胞的免疫反應，如果能排除人畜共患疾病，那么異種細胞就有可能用作為種子細胞，應用到包括食道在內的所有器官組織工程中［43］。

3.2 力學研究

Yang等建立了一種三維組織模型，用于描述非線性、不均質生物器官（如食道）的復雜機械性能［44］。在食道肌層和粘膜層的固定軸伸展的膨脹實驗中，獲得壓力-半徑-軸向力的實驗數據，用于器官模型，得到與結構相關的參數，其中包括膠原蛋白數量和纖維方向。將4參數模型中的雙直線應變量應用于6參數模型，能同時捕獲3種伸展的膨脹行為。實驗發(fā)現，肌層和黏膜層的膠原蛋白優(yōu)先軸向分布，并且黏膜層膠原含量更多，這與單軸抗拉實驗結果吻合。研究者認為，這樣的模型有望應用于生理狀態(tài)下的食道壁壓力的預測，在構建組織工程化食道力學方面的研究中有一定的參考價值和實踐意義。

組織工程化食道應具備一定的機械動力，能和正常食道一樣自主蠕動。Watanabe等在人工食道上嫁接了鎳鈦合金制成的傳動裝置，成螺旋狀排列［45］。在適當的電壓和電流下，人工食道自主收縮，收縮全過程與人類食道在X線下觀察的蠕動相似，為組織工程化動力學方面的研究提供了支持。

4 展望

鑒于上述組織工程化食道研究的成果，食道組織工程將在今后得到更長足的發(fā)展。未來組織工程化食道的研究將首先在種子細胞和支架材料等方面得到突破。

目前，高分子聚合物與天然高分子材料結合，為構建組織工程化食道提供了組織相容性高、便宜且能大規(guī)模生產的基材；而靜電紡絲等新技術的應用，為制備仿生多孔支架材料提供了技術支持，使支架材料能夠為細胞提供更加適宜的環(huán)境，利于其生存、繁殖、分化等。蛋白質組學、基因組學、材料學、計算機等各門學科的飛速發(fā)展，加速了組織工程化食道種子細胞的選擇及培育，增進了組織工程化食道機械動力等方面的研究與探索，為成功構建組織工程化食道打下了堅實的基礎，獲得了諸多方面的支持。

組織工程化食道的研究已取得了很多世人矚目的成績，雖然組織工程化食道成功構建并真正應用于臨床還面臨許多問題，如支架材料的選擇、種子細胞獲得及正常繁育生長、機體抗排異反應、倫理等，但具有與食道相同解剖結構和功能的同種異體組織工程化食道將能構建成功，并成為未來食道癌患者食道移植的理想替代物。

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