臧忠良，毛浩萍，柴麗娟，郭 浩，高慶瑋，劉昌孝，高秀梅

(1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，方劑學教育部重點實驗室，天津市中藥藥理重點實驗室;2.天津藥物研究院，天津 300193)

兒茶酚胺(catecholamine，CA)(包括去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺)是機體維持正常生命活動的內(nèi)源性物質(zhì)，參與機體生理應激變化，太過或不及均會造成病理性損傷。研究表明，兒茶酚胺與許多疾病有關(guān)，如心腦血管疾病、精神病、肥胖、免疫系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)疾病等。通過藥物干預兒茶酚胺的分泌和合成對于預防和治療與兒茶酚胺相關(guān)的疾病具有十分重要的意義。

荷葉(Folium Nelumbinis)是睡蓮科蓮屬植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)的葉，具有清暑利濕、升發(fā)清陽、清心去熱、止血利水的功效?，F(xiàn)代臨床研究表明［1］，荷葉具有降脂減肥、抗氧化與抗衰老、抑制脂肪肝、抑菌、抗病毒、抗炎、抗過敏等作用。荷葉中含有多種生物堿和黃酮類化合物，其中生物堿是荷葉產(chǎn)生強烈抗有絲分裂作用的主要活性成分之一［2］。近年來研究表明［3］，荷葉生物堿(alkaloids from Folium Nelumbinis)通過阻斷鈣離子的跨膜運動能弛緩去甲腎上腺素和KCl誘導的小鼠肌肉收縮，調(diào)節(jié)神經(jīng)反射。鑒于荷葉生物堿的藥理作用與兒茶酚胺異常導致疾病有一定相關(guān)性，本文體外培養(yǎng)擬交感活性的牛腎上腺髓質(zhì)細胞，研究荷葉生物堿對牛腎上腺髓質(zhì)細胞中兒茶酚胺分泌的影響，為荷葉生物堿的臨床應用提供藥理學依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品和試劑牛腎上腺購自天津市北辰屠宰場。KRP 緩沖液由 154 mol·L－1NaCl，5.6 mmol·L－1KCl，1.1 mmol·L－1MgSO4，2.2 mmol·L－1CaCl2和 10 mmol·L－1葡萄糖組成，調(diào)節(jié) pH 至7.4;高鉀溶液為含56 mmol·L－1K+的KRP緩沖溶液;MEM培養(yǎng)基和新生牛血清購自Gibcon(美國Nitrogen公司 );膠原酶購自 Nitta Zerachin(日本大阪);乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、藜蘆定堿(veratridine，Ver)、腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)均購自 Sigma(美國);乙二胺四乙酸二鈉、磷酸、磷酸二氫鉀、高氯酸(PCA)等均為國產(chǎn)分析純，甲醇、乙腈為國產(chǎn)色譜純;荷葉購自安國藥材市場，荷葉生物堿由本實驗室提取分離，含量為50%，其中荷葉堿含量為3.64%。

1.2 儀器Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);DECADEⅡ電化學檢測器(荷蘭ANTECLEY DEN公司);臺式ALLEGRA-64R高速離心機(美國貝克曼公司);熒光成像酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1.1 牛腎上腺髓質(zhì)細胞原代培養(yǎng) 取新鮮的牛腎上腺用組織切片器切取牛腎上腺髓質(zhì)，按照Yanagihara等［4］所述方法用膠原酶消化成單個細胞后，以每孔5×105個細胞的密度種植48孔細胞培養(yǎng)板(Costar，美國)，培養(yǎng)于含10%新生牛血清、1×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素、0.25 mg·L－1兩性酶素B和3μmol·L－1阿糖胞苷的 MEM 培養(yǎng)基中。置于37℃含5%CO2/95%空氣細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d內(nèi)使用。

2.1.2 牛腎上腺髓質(zhì)細胞中CA的分泌 將培養(yǎng)的牛腎上腺髓質(zhì)細胞用KRP緩沖液沖洗3次后于37℃水浴中孵育，分別加入240 μl反應液 (含荷葉生物堿0.005～50 mg·L－1及相應刺激劑的KRP緩沖液或含荷葉生物堿的高K+緩沖液)37℃孵育10 min，10 min 后取出反應液，加入 60 μl 2 mol·L－1PCA溶液終止反應。HPLC-ECD［5］檢測腎上腺素和去甲腎上腺素的量，兩者之和作為細胞分泌CA的量。

收集細胞板上反應液后，取對照孔細胞，用240 μl去離子水(KRP緩沖液)洗刮收集細胞懸液，加入60 μl 2 mol·L－1PCA。3 000 r·min－1離心 10 min后，取上清液 30 μl，加 270 μl去離子水稀釋，用HPLC檢測腎上腺素和去甲腎上腺素，兩者之和的10倍作為細胞總CA量。兒茶酚胺分泌量用細胞分泌CA量占細胞總CA量的百分比表示。

2.1.3 牛腎上腺髓質(zhì)細胞中CA分泌的檢測 色譜柱:SymmetryShieldTMRP18Column(3.9 mm×150 mm，5 μmol·L－1，Waters公司，美國);流動相:甲醇 ∶乙腈 ∶水(含磷酸二氫鉀0.1 mol·L－1、EDTA-Na20.1 mmol·L－1，辛烷磺酸鈉 0.25%，pH 3.4)=12 ∶1 ∶87;流速:1 ml·min－1;柱溫:35℃;ECD工作電壓為+0.7 mV，量程范圍0～200 nA;進樣量:10 μl。

2.1.4 鈣流的檢測 細胞消化成單個后，以每孔5×104個細胞的密度種植于清潔黑底96孔細胞培養(yǎng)板(Greiner，美國)中，于37℃含5%CO2/95%空氣細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，取出細胞并加入鈣-4 試劑(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，37℃孵育CO2培養(yǎng)箱中90 min。然后，用熒光成像酶標儀FlexstationⅢ(Molecular Devices，USA)機械臂加入含荷葉生物堿及刺激劑的溶液，同時以熒光檢測法檢測細胞胞質(zhì)內(nèi)熒光值(熒光分析波長為:λex=485 nm，λem=525 nm，檢測時間5 min)。數(shù)據(jù)用相對熒光單位(RFU)表示，即熒光單位(RFU)與0 s時的RFU百分率之比。

3 結(jié)果

3.1 荷葉生物堿對牛腎上腺髓質(zhì)細胞中不同刺激劑誘導的CA分泌的影響結(jié)果表明:ACh、Ver、高鉀溶液均能刺激牛腎上腺髓質(zhì)細胞中CA的分泌。而50 mg·L－1荷葉生物堿能抑制 ACh、Ver、高鉀誘導的 CA的分泌，其抑制率分別為:42.86%，35.33%，37.46%。與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Effects of alkaloids from Folium Nelumbinis on secretagogues-induced CA secretion( ± s，n=3)

3.2 不同濃度荷葉生物堿對ACh、Ver、高鉀誘導的CA分泌的影響結(jié)果顯示:在0.5、5、50 mg·L－1荷葉生物堿均能抑制ACh、Ver誘導的CA分泌(IC50值分別為 34.85、41.62 mg·L－1)，分別與單用ACh、Ver相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05，P＜0.01)。0.05～50 mg·L－1荷葉生物堿均能抑制高鉀誘導的 CA分泌(IC50=27.63 mg·L－1)，與單用高鉀相比，差異具有統(tǒng)計學意度(P＜0.05，P＜0.01)。Fig 2所示。以上結(jié)果說明，荷葉生物堿能通過ACh、Ver、高鉀3個通道抑制兒茶酚胺的分泌，且均具有劑量依賴關(guān)系。

Fig 2 Effect of alkaloids from Folium Nelumbinis on ACh induced catecholamines secretion( ± s，n=3)

3.3 不同濃度荷葉生物堿對乙酰膽堿誘導的細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響300 μmol·L－1ACh能明顯增加牛腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞中鈣離子濃度，40～60 s細胞內(nèi)鈣離子濃度達到高峰(Fig 3)。不同濃度的荷葉生物堿對ACh引起的鈣離子內(nèi)流具有濃度依賴性抑制作用。與300 μg·L－1ACh組相比，5～50 mg·L－1荷葉生物堿從40～300 s內(nèi)能降低ACh引起的細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05～0.01)。

Fig 3 Time course of intracellular calcium rising induced by acetylcholine in bovine adrenal medullary cells(±s，n=3)

以上結(jié)果表明:荷葉生物堿抑制細胞內(nèi)鈣離子濃度升高與抑制兒茶酚胺分泌結(jié)果一致，說明荷葉生物堿通過煙堿型乙酰膽堿受體抑制鈣離子濃度升高，減少細胞內(nèi)鈣離子濃度，從而達到減少兒茶酚胺分泌作用。

4 討論

腎上腺髓質(zhì)細胞主要由嗜鉻細胞組成，來源于胚胎神經(jīng)嵴，它與交感節(jié)后神經(jīng)元具有許多相同的生理和藥理學特性。腎上腺髓質(zhì)細胞中兒茶酚胺分泌機制與交感神經(jīng)系統(tǒng)中兒茶酚胺分泌類似，已廣泛應用于生化、電生理、神經(jīng)藥理等各領(lǐng)域的研究。在體外培養(yǎng)的腎上腺髓質(zhì)細胞膜上至少有3種不同類型的離子通道參與了CA的分泌［6］:① 煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)離子通道，②電壓門控Na+通道和，③電壓門控Ca2+通道。而乙酰膽堿、藜蘆定堿和56 mmol·L－1高鉀溶液能分別作用于上述3種離子通道而促進CA的分泌，其作用機制與交感神經(jīng)元細胞中去甲腎上腺的分泌和合成機制類似。因此牛腎上腺髓質(zhì)細胞可以作為擬交感模型應用于心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肥胖等藥物研究。

兒茶酚胺在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)正常功能上占有舉足輕重的作用，但是由于應激引起的兒茶酚胺分泌可過量參與并加重諸如心衰、動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓等［7］心血管原發(fā)性疾病。因此研究其在預防和治療與兒茶酚胺相關(guān)的疾病方面具有重要意義。中醫(yī)藥由于其良好的臨床療效和副作用少等特點而日益成為當前研究的熱點。但目前藥物對兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)分泌及其機制的研究國外以化學藥物為主，僅見日本和韓國等少數(shù)實驗室有相關(guān)的中藥研究報道。我們前期研究證實，開竅中藥［8］、丹參酮等［9］能明顯抑制兒茶酚胺的分泌，這也是上述藥物發(fā)揮心腦血管保護作用的機制之一。除此之外，我們還以腎上腺髓質(zhì)細胞為模型，對飛蓬草［10］進行了相關(guān)研究，結(jié)果顯示，飛蓬草提取物具有明顯抑制兒茶酚胺分泌和細胞內(nèi)鈣內(nèi)流的作用。

荷葉在食用和藥用兩方面都具有廣泛的應用，除傳統(tǒng)記載清暑利濕、升發(fā)清陽等功效外，近期研究表明荷葉中的生物堿類成分具有降脂減肥、降低血壓、抗心率失常、解痙攣等作用［11］。此項研究結(jié)果表明，荷葉生物堿可以抑制細胞膜上 nACh受體激動劑ACh、電壓依賴型鈉離子通道開放劑Ver、電壓依賴型鈣離子通道開放環(huán)境的高鉀介導的CA的分泌，且具有劑量依賴性，同時又能明顯抑制ACh誘導的細胞鈣內(nèi)流。說明荷葉生物堿通過減少細胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)揮抑制CA分泌，此項研究結(jié)果提示荷葉除應用于中暑之外，可用于糖脂代謝異常、肥胖、高血壓、心腦血管病等疾病。

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