毛小元，程振國，俞軍齡，閔冬雨，郭 鳳，劉 睿，吳坤燦，張宇軒，謝 妮，蔡際群

癲癇的發(fā)生是由于腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)含量的失衡引起的，γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［1］，目前已發(fā)現(xiàn)［2］，GABA 介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞作用的降低是導(dǎo)致癲癇發(fā)生過程中神經(jīng)元過高興奮性的一個重要原因。

在突觸間隙中，GABA清除的唯一途徑就是通過GABA轉(zhuǎn)運體(GATs)來實現(xiàn)的［3］。分子克隆技術(shù)表明［4］，大鼠腦中 GATs包括4種亞型，即 GAT-1、GAT-2、GAT-3 和 BGT-1。目前研究表明，GAT-1和GAT-3是腦中表達最豐富的兩種亞型，且與癲癇的發(fā)生最為密切［5］。

托吡酯是治療癲癇的良好藥物，其藥理作用表明托吡酯能阻斷興奮性氨基酸受體，增強GABA介導(dǎo)的抑制性作用，從而起到穩(wěn)定細(xì)胞膜，抑制興奮性氨基酸毒性的作用，但是關(guān)于托吡酯對GATs表達的影響，目前僅發(fā)現(xiàn)一篇文獻報道［6］。此外，本研究中采用一種遺傳性癲癇大鼠模型——tremor大鼠(TRM)，它是自發(fā)性癲癇大鼠(SER:zi/zi，tm/tm)親代之一，由Wistar大鼠敲除tm基因而獲得，出生8周后出現(xiàn)癲癇小發(fā)作［7－8］，我們前期工作中，在此大鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)均記錄到陣發(fā)性的5～7 Hz的棘－慢復(fù)合波［9］(如Fig 1所示)，它的發(fā)作無需外加物理化學(xué)因素刺激，是研究遺傳性癲癇的理想動物模型。目前關(guān)于托吡酯對TRM大鼠腦組織內(nèi)GATs表達的影響也未見報道。本研究擬通過幾種實驗方法檢測托吡酯對TRM腦內(nèi)GAT-1和GAT-3 mRNA和蛋白表達的影響，為進一步揭示托吡酯抗癲癇的作用機制及尋找新的藥物靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 主要試劑和儀器 TRM大鼠(tm)由中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2000年從日本京都大學(xué)引進的模型種鼠自行繁殖，Wistar大鼠由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。TRM大鼠、Wistar大鼠均為9～12 wk，♀、♂不限。TRIzol(TaKaRa)，GAT-1、GAT-3 和β-actin引物由 TaKaRa公司合成，托吡酯(topiramate，TPM)購自 Sigma Aldrich公司，SYBR Prime-Script RT-PCR KitⅡ(Perfect Real Time)試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］，兔抗鼠GAT-1和βactin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗鼠GAT-3多克隆抗體(英國Abcam公司)，Real Time PCR儀(ABI 7500 Fast Real-Time PCR System)，DYY-5型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器)，GDS-8000型凝膠成像系統(tǒng)(英國UVP公司)，Hoefer miniVE垂直電泳，印跡系統(tǒng)(美國 Amersham Biosciences公司)。

1.2 實驗動物分組及給藥 取9～12 wk的Wistar大鼠5只和TRM大鼠15只，然后將15只TRM大鼠隨機分成3組，每組各5只。一共分為4組:陰性對照組;TRM組;40 mg·kg－1TPM組(TPM40);80 mg·kg－1TPM 組(TPM80)，TPM40 組和 TPM80 組分別腹腔注射給予相應(yīng)劑量新鮮配置的托吡酯藥物，陰性對照組和TRM組分別在相同時間點腹腔注射生理鹽水(10 ml·kg－1)，動物每次給藥前皆稱體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，每天早晨10點給藥一次，按此方法連續(xù)給藥2周，動物給藥后觀察2 h，以驚厥發(fā)作持續(xù)時間和驚厥發(fā)作次數(shù)進行比較和評價，以全身強直－陣攣作為驚厥發(fā)作的表現(xiàn)。

1.3 SYBR GreenⅠ實時定量 PCR檢測海馬內(nèi)GAT-1和GAT-3 mRNA表達 給藥2 wk后，各組的TRM大鼠和Wistar大鼠在麻醉狀態(tài)下斷頭，迅速取出海馬。參照TRIzol試劑說明書，提取海馬的總RNA，用紫外分光光度計測定RNA樣品的濃度和純度。取5 × Prime ScriptTMBuffer 2 μl，每一標(biāo)本取總RNA 500 ng，Prime Script TMRT Enzyme MixⅠ，Oligo dT Primer和 Random 6 mers各 0.5 μl，加入去 RNA酶的水至 10 μl。37℃，15 min;85℃，5 s 進行逆轉(zhuǎn)錄。將cDNA標(biāo)本進行連續(xù)5倍稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板，同時進行PCR。將不同濃度的定量模板的對數(shù)和相應(yīng)的Ct(threshold cycle，Ct)值作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR反應(yīng)總體積為25 μl，含cDNA 模板(1 ∶5 稀釋)2 μl，上、下游引物各 1 μl，SYBR Premix ExTaqTMⅡ(內(nèi)含 ExTaq 酶、dNTPs、Mg2+和 SYBR Green Ⅰ)12.5 μl，其余的用水補齊。PCR 反應(yīng)條件為 95℃，30 s;95℃，5 s;62℃，34 s共40個循環(huán)，各組都設(shè)2個平行重復(fù)。PCR反應(yīng)在ABI 7500 Real Time PCR儀上進行，采用β-actin作為內(nèi)參(各引物序列如Tab 1所示)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和熔解曲線進行確定分析。

Tab 1 Primer sequences used for GABA transportersdetection by real time PCR

1.4 Western blot檢測海馬突觸膜成分中GAT-1和GAT-3蛋白表達 各組大鼠麻醉狀態(tài)下斷頭迅速剝離海馬，參照Danbolt等［10］的方法提取海馬突觸膜成分的蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法進行蛋白定量，以牛血清蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)。60 μg的蛋白樣品與等體積的RIPA裂解液混合煮沸變性5 min后，采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓120 V，分離膠電壓為180 V。轉(zhuǎn)印至PVDF膜(200 mA，2 h)，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入GAT-1一抗(1∶600)或 GAT-3一抗(1∶600)或β-actin一抗(1∶1 000)室溫孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，測定灰度值。

2 結(jié)果

2.1 TRM大鼠癲癇小發(fā)作的腦電圖與行為學(xué)表現(xiàn)

2.1.1 TRM大鼠癲癇小發(fā)作的腦電圖 TRM大鼠強直痙攣發(fā)作時腦電圖呈現(xiàn)低電壓高頻率的快反應(yīng)波(Fig 1)。

Fig 1 The electroencephalograms(EEGs)recording of TRM(♂，250 g，9 weeks)in cerebral cortex(Cx)and hippocampus(HPC)

2.1.2 行為學(xué)觀察 陰性對照組無驚厥發(fā)作。與TRM組比較，TPM40組驚厥發(fā)作持續(xù)時間和驚厥發(fā)作次數(shù)均明顯縮短，差異有顯著性(P＜0.05);TPM80組驚厥發(fā)作持續(xù)時間和驚厥發(fā)作次數(shù)也明顯縮短，差異有顯著性(P＜0.01)，Tab 2。

Tab 2 The comparison of behavioral findings among groups in the experiment(ˉ±s，n=5)

Tab 2 The comparison of behavioral findings among groups in the experiment(ˉ±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs TRM.

Group Duration of seicure/h Number of attack Wistar－ －－TRM 1.65 ±0.12 11.5 ±0.93 TPM40 1.46 ±0.07* 9.88 ±0.83*TPM80 0.91 ±0.15＊＊ 7.5 ±1.20＊＊

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線見Fig 2，GAT-1、GAT-3 和 β-actin 的 斜 率 分 別 為－3.495 9、－3.430 2和 －3.439 1，均接近 －3.322。GAT-1、GAT-3和β-actin的相關(guān)系數(shù)分別為0.997 2、0.999 6和 0.996 3。GAT-1，GAT-3 和 β-actin基因的線性范圍均為101～104。

Fig 2 Quantitative real-time PCR standard curve of β-actin，GAT-1 and GAT-3 standard templates

2.3 PCR產(chǎn)物的確定分析 GAT-1、GAT-3和 βactin基因PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得目的條帶，沒有出現(xiàn)非特異性條帶(Fig 3A);熔解曲線分析顯示，GAT-1、GAT-3和β-actin基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值分別為85.1℃、86.0℃和86.4℃，熔解溫度均一，峰的形狀也比較銳利(Fig 3B、C)。

2.4 GAT-1和GAT-3在腦組織中的定量分析所有標(biāo)本均重復(fù)2次檢測。為了校正標(biāo)本之間RNA的質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效率的差異，將每一標(biāo)本檢測所得GAT-1和GAT-3基因的拷貝數(shù)均和相對應(yīng)的β-actin基因的拷貝數(shù)相比來進行標(biāo)準(zhǔn)化。GAT-1 mRNA的相對表達量在TRM大鼠的海馬(1.58±0.42)中高于 Wistar正常鼠(0.45±0.33)，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 4A)，同時，與TRM組(1.58±0.42)比較，TPM80組海馬中GAT-1 mRNA(0.86±0.39)的相對表達量明顯降低，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而TPM40組海馬GAT-1mRNA的相對表達量與TRM組比較沒有變化(Fig 4A);GAT-3 mRNA的相對表達量在TRM大鼠海馬(1.40±0.13)中高于 Wistar正常鼠(0.77±0.29)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 4B)。

Fig 3 Agarose gel electrophoresis results and melting curvesanalysis of GAT-1，GAT-3 and β-actin genes

2.5 托吡酯對TRM腦內(nèi)GAT-1和GAT-3蛋白表達的影響 TRM大鼠海馬中GAT-1蛋白(0.61±0.07)的表達高于正常Wistar大鼠(0.34±0.06)，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 5A);同時，與TRM組(0.61±0.07)比較，TPM80組海馬中GAT-1蛋白(0.17±0.05)的表達明顯降低，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而TPM40組海馬中GAT-1蛋白(0.56±0.10)的表達與TRM組比較沒有變化。TRM大鼠海馬中GAT-3蛋白(0.76±0.07)的表達高于正常Wistar大鼠(0.46±0.05)，P ＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 5B)。

Fig 4 The effects of topiramate on GAT-1 and GAT-3 geneexpressions in the hippocampus of TRM(ˉ±s，n=5)

3 討論

本實驗中采用的癲癇模型鼠為遺傳性癲癇大鼠(TRM)，腦電圖顯示，在出生后8周能自發(fā)地出現(xiàn)低電壓高頻率的快反應(yīng)波，并且其對抗癲癇藥物的反應(yīng)與人類十分相似［11］，是評價抗癲癇藥的極好動物模型。而與TRM同窩的野生型WTC鼠無癲癇相關(guān)的突變基因，在腦內(nèi)未記錄到癲癇相關(guān)的腦電波，我們認(rèn)為其與正常Wistar大鼠無差異，由于WTC鼠數(shù)量很少，故本實驗采用Wistar鼠作對照。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TRM大鼠海馬內(nèi)GAT-1和GAT-3 mRNA和蛋白均上調(diào)［12］，這與現(xiàn)在的研究結(jié)果是一致的。

Fig 5 The effects of topiramate on GAT-1 and GAT-3 proteinexpressions in the hippocampus of TRM(ˉ±s，n=5)

腦內(nèi)GATs的改變與癲癇的發(fā)生之間的關(guān)系越來越引起廣大研究者的關(guān)注，目前研究發(fā)現(xiàn)許多抗癲癇藥物的作用機制都與調(diào)節(jié)GATs密切相關(guān)［13－14］。托吡酯是一種具有多種作用機制的新型抗癲癇藥，易于透過血－腦屏障。主要藥理機制有:①阻斷電壓依賴性鈉通道;② 激活 γ-氨基丁酸(GABA)引發(fā)的Cl－內(nèi)流，增強GABA的活性;③ 阻滯KA/AMPA型谷氨酸受體。Poulsen等［15］研究發(fā)現(xiàn)托吡酯還可以通過增加谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達來減少海馬胞外谷氨酸水平從而發(fā)揮抗癲癇的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)托吡酯對TRM的發(fā)作癥狀具有明顯的抑制作用，主要表現(xiàn)在驚厥持續(xù)時間和驚厥發(fā)作的次數(shù)上。此外，托吡酯可以降低 TRM大鼠海馬內(nèi)GAT-1mRNA和蛋白的表達，并且這種調(diào)節(jié)存在劑量依賴性，但是它對GAT-3mRNA和蛋白的表達沒有影響，推測托吡酯發(fā)揮抗癲癇作用的機制可能也是通過調(diào)節(jié)GAT-1來實現(xiàn)的，至于具體的分子細(xì)胞學(xué)機制尚需進一步研究。

(致謝:感謝日本京都大學(xué)芹川忠夫教授友情贈送TRM種鼠。)

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