鄧 波,李凱航,薛 霞,孫泉云*

(1.上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海201103;2.上海交通大學(xué),上海200240)

近年來,由于禽流感病毒的變異,水禽在病毒傳播過程中所扮演的角色已經(jīng)發(fā)生改變,由不易感但能帶毒的貯存宿主演變?yōu)橐赘袆游?所以鴨禽流感的監(jiān)測工作具有更加重要的意義[1-5]。然而,在鴨禽流感血清抗體的監(jiān)測工作中,常遇到鴨血清對雞紅細(xì)胞懸液的非特異凝集現(xiàn)象,造成在血凝抑制試驗結(jié)果判定時,雞紅細(xì)胞不流淌或流淌不完全,給結(jié)果判定造成嚴(yán)重干擾[6-10]。

為尋求能有效去除鴨血凝抑制試驗(HI試驗)中非特異現(xiàn)象,且便于應(yīng)用的測定方法,我們選取了能夠去除水禽血清中非特異性抑制因子的50 mL/L雞紅細(xì)胞吸附預(yù)處理法和同源鴨紅細(xì)胞直接測定法,以比較其檢測效價和判定效果。

1 材料與方法

1.1 材料

禽流感H5亞型HI抗原,重組H5亞型禽流感油乳劑滅活苗,由哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞懸液 10 mL/L、50 mL/L雞紅細(xì)胞懸液,10 mL/L鴨紅細(xì)胞懸液按GB/T 18936—2003方法進(jìn)行制備。

1.2.2 免疫程序 11日齡時進(jìn)行免疫,分組情況如下:A、B組免疫接種0.5 mL,C組免疫接種0.8 mL,D組免疫接種1 mL,E組為非免疫對照組;39日齡時B組1 mL劑量二免;A,B,C,D組每組30羽,E組40羽,每次隨即抽取20羽。

1.2.3 血清準(zhǔn)備 選定奉賢某鴨場為實驗場,購買實驗鴨160羽,按照免疫方案每隔5 d采集白羽肉鴨血清,共采集900份樣品。進(jìn)行初步體液抗體檢測后,選定具代表性的血清60份進(jìn)行重復(fù)試驗。

1.2.4 紅細(xì)胞配制 按如下4種方法進(jìn)行鴨血清禽流感H5亞型抗體效價檢測。A組10 mL/L雞紅細(xì)胞直接測定法;B組10 mL/L鴨紅細(xì)胞直接測定法;C組50 mL/L雞紅細(xì)胞吸附+雞紅細(xì)胞測定;D組50 mL/L雞紅細(xì)胞吸附+鴨紅細(xì)胞測定。

吸附方法是在每0.5 mL的樣品血清中加入0.025 mL的雞紅細(xì)胞,輕搖后靜置至少30 min;800 r/min離心2 min～5 min,收集上清,即為處理后的血清。

2 結(jié)果

分別用雞紅細(xì)胞懸液、鴨紅細(xì)胞懸液對60份鴨血清進(jìn)行HI試驗。

4種測定方法非特異性凝集現(xiàn)象去除效果對比見表1;4種測定方法之間使用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗結(jié)果見表2;4種測定方法血清效價具體結(jié)果見表3(效價單位為Log2)。

表1中,2列凝集數(shù)/凝集率分別是指“第1孔～2孔出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的凝集數(shù)/凝集率”與“2孔以后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的凝集數(shù)/凝集率”,采用4種方法總凝集率分別為:48.3%、15.0%、13.3%、8.3%。其中,第1～2孔出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的凝集率分別為36.7%、6.7%、11.6%、5.0%;2孔以后出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的凝集數(shù)/凝集率分別為11.7%、8.3%、1.7%、3.3%。

表2中,B、C、D 3種方法分別和A法進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,B、C、D法測得的效價與A法差異不顯著(P＞0.05)。

表3為60份血清分別用4種方法檢測后的結(jié)果匯總。

表1 4種測定方法非特異性凝集現(xiàn)象去除效果對比Table 1 Results of 4 methods to remove the nonspecific agglutination reaction

表2 四種方法t檢驗Table 2 Results of 4 methods for t-test

表3 四種測定方法血清效價結(jié)果T able 3 Results of 4 methods to determine the antibody titre

3 討論

從表1結(jié)果來看,血清經(jīng)50 mL/L雞紅細(xì)胞吸附處理后,非特異性凝集率由A法的48.3%下降至C法的13.3%,而D法的非特異性凝集率則可以下降到8.3%,表明D法在去除非特異性凝集因子方面較理想。A法的非特異性凝集主要出現(xiàn)在前兩孔,達(dá)到總非特異性凝集量的75.9%,說明非特異性凝集以前兩孔為主。B法相對于A法在降低前兩孔的非特異性凝集率上效果明顯,C法相對于A法在降低兩孔以后的非特異性凝集上效果明顯,D法在去除非特異性凝集上整體效果最好。在消除非特異性因子方面,采用D法能夠獲得理想結(jié)果。

B法檢測血清無須前處理,具有操作簡便、耗時短的優(yōu)點(diǎn),與國標(biāo)方法相比較,血清效價差異介于1 log2～3 log2之間,非特異性凝集率有所降低。統(tǒng)計分析顯示,B、C、D法測得的效價與A法差異不顯著,說明這3種方法和國標(biāo)法符合率高,對真實效價不會產(chǎn)生偏差。但在小樣本量檢測時,為了降低因非特異性造成的偏差,可以選擇B法或者D法。

在日常檢測中可以使用B法進(jìn)行大樣本量的檢測。在進(jìn)行課題研究等小樣本、高精度要求的檢測時,適宜使用D法以更有效去除非特異性反應(yīng)。

[1] John C.Standardized viral hemagglution and hemagglutination inhibition tests[J].Microbiology,1969,18(5):824-833.

[2] 賈英科,周 蓉,王 雪,等.鴿子血清非特異性凝集因子消除試驗的研究[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2003,10(4):21-24.

[3] Shortridge K F,Lansdell A.Serum inhibitors of A2/Hongkong influenza virus hemagglutination[J].Microbios,1972,6:213-219.

[4] William F F,Edwards S M,Whatlay L R,et al.The nature of non-specific inhibition of virus hemagglutination[J].Ex p Med,1947,86:65-75.

[5] 甘孟侯.禽流感[M].北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002.

[6] 楊秀環(huán),鄭瑞唪,韋海濤,等.不同種家禽紅細(xì)胞對水禽禽流感抗體效價的影響[J].當(dāng)代畜牧,2007(1):10-12.

[7] 李凱航,薛 霞,鄧 波,等.鴨血清禽流感血凝抑制試驗中非特異性因子去除方法研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2009(9):95-96.

[8] 李凱航,薛 霞,鄧 波,等.白羽肉鴨免疫重組H5亞型禽流感滅活疫苗后體液抗體和細(xì)胞因子水平變化研究[J].福建畜牧獸醫(yī),2009(1):6-7.

[9] 張評滸,任 濤,唐應(yīng)華,等.免疫程序與母源抗體對H5禽流感疫苗免疫鴨和鵝HI抗體水平的影響[J].中國獸醫(yī)科技,2005(8):13.

[10] 張評滸,唐應(yīng)華,仇旭升,等.不同家禽紅細(xì)胞懸液對禽流感血清抗體檢測的影響[J].中國獸醫(yī)科技,2005(4):267-271.