馮學(xué)忠,吳廣輝,方炳虎,梁德永,黃麗梅

(1.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司,廣東新興527400;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510642)

硫酸卡那霉素為氨基糖苷類抗生素[1],對(duì)大多數(shù)革蘭陰性桿菌如大腸埃希菌、變形桿菌、沙門菌、多殺性巴氏桿菌等有強(qiáng)大抗菌作用,金黃色葡萄球菌和結(jié)核桿菌也對(duì)其敏感[2]。內(nèi)服可用于治療敏感菌所致的腸道感染;肌肉注射用于敏感菌所致的各種嚴(yán)重感染,如敗血癥、泌尿生殖道感染、呼吸道感染、皮膚和軟組織感染等[3]。生產(chǎn)中可用于緩解豬喘氣病癥狀[4]。硫酸卡那霉素注射液的含量測(cè)定在《中國(guó)獸藥典》2005年版一部中采用抗生素微生物檢定法[5],由于該法測(cè)定費(fèi)時(shí),不適于作為生產(chǎn)過程中中間產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。本文采用紫外分光光度法[6]測(cè)定硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量[7-13],經(jīng)與抗生素微生物檢定法比較,結(jié)果基本一致。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UV-2450型紫外可見分光光度計(jì),日本島津產(chǎn)品;CP225D型電子天平,德國(guó)賽多利斯有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 藥品 硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品,批號(hào)為K0080807(效價(jià):每1 mg相當(dāng)于694卡那霉素單位)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;硫酸卡那霉素注射液,規(guī)格為10 mL∶1.0 g(100萬(wàn)單位),批號(hào)為20091001,20091002,20091003,廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司產(chǎn)品;硫酸為分析純;水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 卡那霉素檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 精密稱取硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品27.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加水溶解,并稀釋至刻度,搖勻;精密量取2 mL,置于50 mL容量瓶中,加硫酸10 mL,水浴30 min,冷卻,加水離刻度約1 cm,放冷,再加水至刻度,搖勻。用水作為參比液,按照紫外分光光度法,在190 nm～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行圖譜掃描。

1.2.2 水解條件的選擇 取1.2.1項(xiàng)下配制的溶液2 mL數(shù)份,置于50 mL容量瓶中,各加硫酸5 mL、10 mL,分別水浴10、20、30、40、50 min,然后按1.2.1項(xiàng)下操作,測(cè)定其吸收度。

1.2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品9.0、18.0、27.0、36.0、45.0 mg,分別置于50 mL容量瓶中,加水使之溶解,并稀釋至刻度,搖勻,按1.2.1項(xiàng)下方法稀釋成5、10、15、20、25 U/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,以水為參比液,參照紫外分光光度法,在279 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取硫酸卡那霉素注射液(批號(hào):20091001)3 mL,置200 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;精密量取25 mL,置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;再按1.2.1項(xiàng)下方法稀釋至刻度,搖勻,室溫避光,靜置0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,以水為參比液,按照紫外分光光度法,在279 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.5 空白試驗(yàn) 按處方比例稱取輔料適量,制備不含硫酸卡那霉素的空白樣品,按1.2.4項(xiàng)下方法稀釋并測(cè)定吸光度。

1.2.6 回收試驗(yàn) 精密稱取卡那霉素對(duì)照品18.0、27.0、36.0 mg各3份,分別置50 mL容量瓶中,按處方量加入其他輔料,加溶劑溶解,搖勻,制成小樣,分別精密量取2 mL,置50 mL容量瓶中,按1.2.1項(xiàng)下方法稀釋至刻度,搖勻,并測(cè)定其吸光度。

1.2.7 精密度試驗(yàn) 精密量取硫酸卡那霉素注射液(批號(hào):20091001)3 mL,按1.2.4項(xiàng)下方法稀釋至刻度,搖勻;作為測(cè)定硫酸卡那霉素注射液精密度試驗(yàn)用溶液,并測(cè)定吸光度,重復(fù)測(cè)定5次,進(jìn)行精密度測(cè)定。

1.2.8 紫外分光光度法與抗生素微生物檢定法測(cè)定硫酸卡那霉素注射液含量比較

1.2.8.1 紫外分光光度法 取批號(hào)為20091001、20091002、20091003的硫酸卡那霉素注射液,精密量取3 mL,分別置于200 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;精密量取25 mL,置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;再精密量取2 mL,置50 mL容量瓶中,加硫酸10 mL水浴30 min,冷卻,加水離刻度約1 cm,放冷,再加水至刻度,搖勻,按照紫外分光光度法測(cè)定;另取硫酸卡那霉素對(duì)照品適量,同法測(cè)定,并記錄結(jié)果;計(jì)算出含量。

1.2.8.2 抗生素微生物檢定法 取批號(hào)20091001,20091002,20091003的硫酸卡那霉素注射液,精密量取本品適量,分別用滅菌水定量制成每1 mL中約含1 000單位的溶液,照抗生素微生物檢定法測(cè)定。1 000卡那霉素單位相當(dāng)于1 mg的卡那霉素。記錄結(jié)果,計(jì)算出含量。

2 結(jié)果

2.1 卡那霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)

結(jié)果如圖1所示。樣品在波長(zhǎng)279 nm±1 nm處有最大吸收。因此,選擇279 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 卡那霉素紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 The UV map of kanamycin

2.2 水解條件的確定

結(jié)果表明,加硫酸10 mL,水浴30 min,卡那霉素與硫酸反應(yīng)基本穩(wěn)定,故選擇加硫酸量10 mL,水浴30 min為水解條件。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果如表1所示。以吸光度(A)為縱坐標(biāo),濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.037 3 C+0.003 2(R=0.999 6,n=5,C的單位為U/mL)。結(jié)果表明,在5 U/mL～25 U/mL的濃度范圍內(nèi),濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系(圖2)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度Table 1 The absorbency of standard solution

圖2 卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of kanamy cin

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表2可見,硫酸卡那霉素注射液在2.5 h內(nèi)吸光度值基本保持不變,穩(wěn)定性良好。

表2 硫酸卡那霉素注射液的穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 2 The stability test of kanamycin sulfate injection

2.5 空白試驗(yàn)

結(jié)果顯示,不含卡那霉素的空白樣品無(wú)吸收,即輔料對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾,符合要求。

2.6 回收率試驗(yàn)

按下式計(jì)算含量,并求出回收率,平均回收率為100.3%,RSD為1.8%,結(jié)果如表3所示。

式中:A為測(cè)得的吸光度值;N為稀釋倍數(shù);V為量取樣品的體積(mL);P為樣品規(guī)格10 mL∶1.0 g(100萬(wàn)單位);0.0032為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;26.81為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)。結(jié)果表明,硫酸卡那霉素注射液回收率試驗(yàn)符合要求。

2.7 精密度試驗(yàn)

硫酸卡那霉素注射液含量的RSD為0.1%,結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明,本法具有良好的精密度。

表3 硫酸卡那霉素注射液回收率試驗(yàn)Table 3 The recovery rate of kanamy cin sulfate injection

表4 精密度試驗(yàn)Table 4 P recision test of kanamycin sulfate injection

2.8 紫外分光光度法與抗生素微生物檢定法測(cè)定硫酸卡那霉素注射液含量的比較

結(jié)果如表5所示。表明紫外分光光度法與抗生素微生物檢定法測(cè)得的含量結(jié)果基本一致。

表5 硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量測(cè)定Table 5 Determination of kanamycin content in injection

3 討論

本研究表明,用紫外分光光度法和抗生素微生物檢定法分別測(cè)定硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量,結(jié)果基本一致,說(shuō)明紫外分光光度法可行?？敲顾氐某Ｓ脺y(cè)定方法有抗生素微生物檢定法、旋光法[14]、高效液相色譜(HPLC)法[15-16]等?？股匚⑸餀z定法雖然準(zhǔn)確,但環(huán)境條件要求高,測(cè)定周期長(zhǎng),操作復(fù)雜,無(wú)法達(dá)到快速的要求,而且難以區(qū)分卡那霉素和其他抗生素藥物;旋光法則分辨能力及重現(xiàn)性較差,準(zhǔn)確性較低;高效液相色譜法雖然準(zhǔn)確,但成本昂貴,操作繁瑣,而紫外分光光度法所用儀器較普遍,操作簡(jiǎn)便、快速,重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好,結(jié)果準(zhǔn)確,而且本方法使用的試劑量少,化學(xué)反應(yīng)過程簡(jiǎn)單,具有一定的優(yōu)越性。因此,建議獸藥生產(chǎn)企業(yè)采用紫外分光光度法作為生產(chǎn)硫酸卡那霉素注射液過程中中間產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。

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