李蘭芳 李存滿(mǎn) 張勤增 郝娜 解麗君 李國(guó)風(fēng)

紫苜蓿為多年生草本豆科苜蓿屬植物,是我國(guó)種植面積最廣,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最全面的牧草。民間用全草治療痢疾、黃疸、尿酸性膀胱結(jié)石、尿路結(jié)石和浮腫等[1]。苜蓿多糖具有增強(qiáng)免疫和抗腫瘤作用[2]。近年國(guó)內(nèi)、外學(xué)者研究了苜蓿皂苷降低實(shí)驗(yàn)性高膽固醇血癥,并在幾種動(dòng)物得到證實(shí)[3,4]。本文研究紫苜蓿提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗炎、鎮(zhèn)痛方面的藥理作用,為紫苜蓿的進(jìn)一步深開(kāi)發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠和昆明種小鼠.購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2003-1-003合格證編號(hào)分別為：DK0412-0078,604076,DK0502-0067,604107,604075。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器 紫苜蓿,采自河北滄州黃驊苜蓿基地,經(jīng)河北省藥檢所鑒定為紫苜蓿全草,紫苜蓿干品,加 10倍量水,浸泡 2h,煎煮 2次,45 min/次,合并兩次煎煮液并濃縮至適量,加乙醇至含醇量達(dá) 70%,4℃冷藏過(guò)夜,過(guò)濾,濾液回收乙醇,并濃縮至 1 g生藥/m l的濃度,作為實(shí)驗(yàn)用樣品溶液;角叉菜膠(Carrageean),Sigma公司生產(chǎn);阿司匹林片,25mg/片,石家莊神威藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：20020710)醋酸潑尼松,山東新華制藥廠(批號(hào)：2000902)DT2000電子天平,常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;JA 2003電子分析天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司;TDL-5-A型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)二甲苯引起的小鼠耳腫脹的影響[5]健康昆明科小鼠50只,體重(20±2)g,隨機(jī)分為 5組,即模型組、陽(yáng)性藥組(醋酸潑尼松,12mg/kg)、紫苜蓿提取物 3個(gè)劑量組(40.0、20.0、10.0 g生藥/kg),每組 10只,5組均灌胃給藥,連續(xù) 3 d,給藥體積為 20m l/kg。末次給藥后30min,將二甲苯滴于小鼠右耳,15min處死動(dòng)物,用 6mm打孔器沿左、右耳廓相同部位打孔,兩側(cè)耳片分別稱(chēng)重,以?xún)啥亓坎钪底鳛槟[脹程度指標(biāo),求出抑制率,比較各組差異。見(jiàn)表 1。紫苜蓿提取物 40.0、20.0、10 g生藥/kg連續(xù)給藥 3 d,對(duì)二甲苯引起的小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用(P＜0.05或 ＜0.01)。高、中劑量組對(duì)小鼠耳腫脹的抑制率同醋酸潑尼松相當(dāng)。

表 1 紫苜蓿提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 n=10

2.2 對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響[5]取健康SD大鼠50只,雄性,隨機(jī)分為 5組,即空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液)、陽(yáng)性藥組(阿司匹林 24mg/kg)、苜蓿提取物 3個(gè)劑量組(30.0、15.0、7.5 g生藥/kg)。 5組均灌胃給藥 5 d,于最后 1 d給藥后 1 h,于大鼠右后足趾皮下注入 1%角叉菜膠 0.1m l/只,致炎后 1、2、4、6h分別測(cè)定足趾厚度,計(jì)算腫脹率,分別比較各時(shí)間點(diǎn)給藥組與模型組之間的差異。結(jié)果見(jiàn)表 2。苜蓿提取物高、中、低劑量組從致炎后第 4小時(shí)開(kāi)始有明顯的抑制作用,持續(xù)到 6 h時(shí)抑制作用更為明顯,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 ＜0.01),抑制作用強(qiáng)度同阿司匹林組相當(dāng)。

表2 紫苜蓿提取物對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響n=10,±s

表2 紫苜蓿提取物對(duì)角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響n=10,±s

注：與模型組比較,＊P＜0.05,#P＜0.01

組別 劑量(g生藥 /kg)致炎后不同時(shí)間腫脹率(%)1h 2 h 4 h 6 h模型組 - 38±9 61±21 71±25 68±24高劑量組 30.0 36±10 46±12 43±20＊ 36±17#中劑量組 15.0 44±10 48±10 49±15＊ 43±13#低劑量組 7.5 41±13 48±16 50±13＊ 45±17＊阿司匹林組 24mg/kg 42±8 50±11 52±9＊ 42±10#

2.3 對(duì)大鼠棉球肉芽腫增生模型的影響 選用 SD大鼠 50只,雌雄各半,體重(150±20)g乙醚麻醉,背位固定,下腹部去毛,常規(guī)皮膚消毒。下腹部切口,以血管鉗向左右兩側(cè)蹊部擴(kuò)充皮下組織,將已稱(chēng)重并滅菌干燥的 30mg棉球植入皮下,縫合傷口。于術(shù)后當(dāng)天,將動(dòng)物隨機(jī)分為 5組,每組 10只,分別為紫苜蓿提取物 3個(gè)劑量組(30.0、15.0、7.5 g生藥/kg),陽(yáng)性對(duì)照藥給予醋酸潑尼松(8mg/kg)和模型組。5組均灌胃給藥,灌胃容積均為 2.0ml/100g,模型組給予蒸餾水,1次/d,連續(xù) 7 d。于第 8天脫臼處死動(dòng)物,取出棉球,精稱(chēng)濕重,于 60℃烤箱干燥12 h,精稱(chēng)干重,減去原棉球重量即為肉芽腫凈重(mg)。與模型組比較,醋酸潑尼松(25mg/kg)效果顯著(P＜0.01);紫苜蓿提取物高、中劑量組(30.0、15.0 g生藥/kg),對(duì)大鼠棉球肉芽腫增生均有明顯抑制作用(P＜0.01)。見(jiàn)表 3。

2.4 對(duì)醋酸所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響 選用健康昆明種小鼠50只,雌雄各半體重(18±2)g,隨機(jī)分為 5組,模型組、陽(yáng)性藥組(阿司匹林片,30mg/kg),紫苜蓿提取物 3個(gè)劑量組(40、20、10 g生藥/kg。各組均灌胃給藥,連續(xù) 5 d,給藥體積為20ml/kg。末次給藥后 1 h,腹腔注射 0.6%醋酸溶液,0.2m l/只。觀察記錄各組小鼠 30m in內(nèi)扭體次數(shù),比較各組動(dòng)物扭體次數(shù)差異。見(jiàn)表 4。與模型組比較,紫苜蓿提取物 40、20、10 g生藥/kg連續(xù)給藥 5 d,可明顯減少醋酸引起的小鼠疼痛模型的扭體次數(shù)(P＜0.01)。作用強(qiáng)度與陽(yáng)性藥阿司匹林相當(dāng)。

表3 苜蓿提取物對(duì)大鼠棉球肉芽腫增生的影響n=10,±s

表3 苜蓿提取物對(duì)大鼠棉球肉芽腫增生的影響n=10,±s

注：與模型組比較,＊P＜0.01

組別 劑量(g生藥/kg)肉芽腫濕重(mg, ±s)肉芽腫干重(mg,±s)抑制率(%)模型組 - 420±43 57±10 -醋酸潑尼松組 10mg/kg 340±38＊ 30±7＊ 47.52高劑量組 30.0 368±39＊ 39±10＊ 32.26中劑量組 15.0 366±40＊ 45±10＊ 20.80低劑量組 7.5 394±51 49±16 14.04

2.5 對(duì)熱水縮尾法疼痛模型的影響[5]取健康昆明種小鼠,雌雄兼用,體重(18±2)g,將小鼠尾尖端 3 cm浸入 50℃恒溫水浴鍋中,記錄其縮尾的潛伏期為痛閾指標(biāo),測(cè)兩次(間隔10min),求其平均值,取潛伏期是 5～30 s的為合格鼠,剔除過(guò)敏(＜5 s)或反應(yīng)遲鈍(＞30 s)的個(gè)體。24h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),取合格小鼠 50只,隨機(jī)分為 5組,即苜蓿提取物 3個(gè)劑量組(40、20、10 g生藥/kg),陽(yáng)性藥組(阿司匹林 30mg/kg)和空白對(duì)照組,每組 10只。5組動(dòng)物均灌胃給藥 3 d,空白對(duì)照組給予蒸餾水。末次給藥后 30min,將小鼠尾尖端 3 cm浸入 50℃的恒溫水浴鍋中,測(cè)定各組小鼠的縮尾潛伏期,以小鼠尾回縮出水面的潛伏期作為測(cè)痛指標(biāo)。苜蓿提取物高、中劑量組能提高熱水縮尾實(shí)驗(yàn)中小鼠縮尾的痛閾,使縮尾潛伏期延長(zhǎng),與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 ＜0.01)。見(jiàn)表5。

表4 苜蓿提取物對(duì)醋酸所致小鼠疼痛模型的影響 n=10

表 5 苜蓿提取物對(duì)熱水所致的小鼠縮尾潛伏期的影響 n=10

3 討論

炎癥的臨床特征為紅、腫、熱、痛,是致炎因子刺激具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)局部損傷的反應(yīng)。在炎癥早期,血管受到刺激,血管內(nèi)皮間隙擴(kuò)大,血管壁通透性增強(qiáng),白細(xì)胞和蛋白質(zhì)等滲出到組織間隙,造成組織腫脹。因此,腫脹是炎癥早期的重要指標(biāo)。在炎癥晚期和慢性炎癥期,由于內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞等增生,形成肉芽組織增生。

本文采用炎癥腫脹模型觀察了苜蓿水煎液用 70%乙醇沉淀后的提取物對(duì)二甲苯引起小鼠耳腫脹和角叉菜膠對(duì)大鼠足趾腫脹的影響,在本實(shí)驗(yàn)劑量下,苜蓿提取物能對(duì)炎癥早期的組織腫脹有顯著的抑制作用。采用在大鼠皮下埋植棉球的方法,觀察到苜蓿提取物對(duì)炎癥的增殖期肉芽腫形成有顯著的抑制作用。提示苜蓿提取物既能抑制炎癥早期的水腫和滲出,又可抑制炎癥晚期的組織增生和肉芽組織的形成,顯示了很好的抗炎作用。

疼痛是由于痛覺(jué)感受器受到刺激而產(chǎn)生興奮,沖動(dòng)經(jīng)傳入神經(jīng)纖維到達(dá)大腦某些神經(jīng)細(xì)胞,或中樞通路的某一水平受損時(shí)所產(chǎn)生的一種不舒適的感覺(jué)。引起疼痛的原因眾多,本文采用化學(xué)刺激致痛法觀察到,苜蓿提取物對(duì)醋酸引起的疼痛有顯著的抑制作用。對(duì)熱刺激引起的疼痛也有較明顯的延長(zhǎng)反應(yīng)潛伏期的作用。

前期研究有關(guān)于苜蓿可以協(xié)同 PrCl3鎮(zhèn)痛作用的報(bào)道[6],有關(guān)苜蓿單獨(dú)使用在抗炎、鎮(zhèn)痛方面尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。苜?；瘜W(xué)成分復(fù)雜,現(xiàn)已確定皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、蛋白、多糖等,活性研究集中在營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)血脂等。但在本研究采用抗炎和鎮(zhèn)痛模型證實(shí)了苜蓿提取物有很好的抗炎痛作用。并且發(fā)揮藥效時(shí)間短,作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),存在一定的劑量效應(yīng)。

但本實(shí)驗(yàn)對(duì)苜蓿提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛作用只是進(jìn)行了初步的研究。提取方法采用水煎醇沉的傳統(tǒng)方法,其中的成分比較復(fù)雜,動(dòng)物的服用劑量較高,在以后的工作中擬對(duì)苜蓿提取物有效部位和化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步分離和純化和鑒定,確定苜?？寡?、鎮(zhèn)痛的有效成分,進(jìn)一步探討其抗炎、鎮(zhèn)痛機(jī)制及其在體內(nèi)的代謝規(guī)律,為苜蓿的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 宋立人,洪恂,丁旭亮,等主編.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典(上冊(cè)).第 1版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2001.1237.

2 趙武迷,張玉琴,任麗娟,等,苜蓿多糖的免疫增強(qiáng)效應(yīng).中國(guó)藥理學(xué)報(bào),1993,14：273-276.

3 Malinow MR,Mc laughlin P,Stafford C,etal.Alfalfasaponinsand alfalfasccds dietary effects in cholesterol-fed rabbits.Atherosclerosis,1978,30：27.

4 叢學(xué)滋,秦孟根,李子行,等.苜蓿皂甙的降血膽固醇及減輕實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1988,4：293-296.

5 徐叔云主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué).第 3版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2002.882-888,911.

6 楊蔚,王紹.PrCl3與苜蓿皂甙的協(xié)同鎮(zhèn)痛作用.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1995,21：571-573.