劉娟 趙紅宇 軒東英 謝寶儀 章錦才

（廣東省口腔醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙周病科，廣東 廣州 510280）

人牙周膜細胞群多向分化潛能的實驗研究

劉娟 趙紅宇 軒東英 謝寶儀 章錦才

（廣東省口腔醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 牙周病科，廣東 廣州 510280）

目的 研究體外培養(yǎng)的人牙周膜細胞群（hPDLP）向成骨和成脂方向分化的潛能，為牙周組織工程提供可靠的種子細胞來源。方法 組織塊法分離培養(yǎng)人牙周膜細胞群，流式細胞術(shù)檢測間充質(zhì)干細胞標(biāo)記CD146和STRO-1的表達；利用茜素紅、油紅O染色、免疫組化以及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等檢測hPDLP的多向分化標(biāo)志。結(jié)果 第1代hPDLP的CD146和STRO-1陽性率分別是27.20%±3.98%和4.23%±4.08%；經(jīng)礦化誘導(dǎo)可以形成礦化結(jié)節(jié)，有鈣鹽沉積；經(jīng)成脂誘導(dǎo)可見特異性脂滴形成，特異性轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體激活物增生受體2（PPARγ2）和脂蛋白脂酶（LPL）表達上調(diào)。第8代hPDLP相對第1代的礦化能力沒有差異，但成脂方向分化潛能減弱。結(jié)論 體外培養(yǎng)的hPDLP具有向成骨和成脂樣細胞分化潛能，第1～3代細胞群明顯具有牙周膜干細胞的多向分化潛能優(yōu)勢。

人牙周膜細胞群； 分化潛能； 礦化； 誘導(dǎo)

近年來，研究者[1-4]發(fā)現(xiàn)，牙周膜細胞具有異質(zhì)性，包含異質(zhì)性細胞群,即由不同的亞型組成,細胞間存在差異,在表現(xiàn)型及功能上有所不同,其子代能增殖產(chǎn)生成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞。這些細胞亞型可處于不同的分化階段或具有不定向的分化趨勢，牙周組織再生修復(fù)與牙周膜細胞的異質(zhì)性有密切關(guān)系。牙周膜細胞作為一個細胞群體,具有很強的分化增殖能力，其中含有大量未分化的功能細胞。2004年Seo等從牙周膜中分離并培養(yǎng)了間充質(zhì)樣干細胞，發(fā)現(xiàn)這些細胞表面表達間充質(zhì)干細胞的表面標(biāo)記STRO-1和CD146/MUC18，體外培養(yǎng)能夠形成牙周膜樣結(jié)構(gòu)，并首次提出了人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cell，hPDLSC）的概念。牙周膜干細胞同其他組織的成體干細胞一樣，目前尚缺乏特異性的表面標(biāo)記對其進行鑒定和分離純化。本實驗擬通過研究具有異質(zhì)性人牙周膜細胞群（human periodontal ligament cell population，hPDLP）的多項分化潛能，揭示hPDLP的干細胞成分特征，為以牙周膜細胞群為種子細胞的牙周組織工程研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)液、FBS（Gibco公司，美國），胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉（β-glycerophyosphate，β-GP）、消炎痛、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-xanthine，IBMX）、胰島素、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）（Sigma公司，美國），鼠抗人STRO-1多抗、鼠抗人CD146多抗（R＆D Systems公司，美國），CO2細胞培養(yǎng)孵箱（Heraeus公司，德國），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），低溫高速離心機（Heraeus公司，德國），倒置顯微鏡及照像系統(tǒng)（Olympus公司，日本）。

1.2 組織塊法細胞原代培養(yǎng)

收集臨床上12～18歲因正畸需要拔除的牙周健康、無齲的新鮮前磨牙，拔除后立即在雙抗PBS液和DMEM液中反復(fù)清洗牙齒，刮下根中1/3牙周膜組織，剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm左右的小塊。以5mm的間隔將所得的組織塊均勻地接種在25 cm2培養(yǎng)瓶瓶底，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，向內(nèi)加入4mL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100μmol·L-1抗壞血酸，2mmol·L-1谷胺酰胺，100U·mL-1青霉素，100μg·mL-1鏈霉素），置二氧化碳培養(yǎng)箱（5%CO2、100%濕度、37℃恒溫）孵育2 h，使組織塊貼壁，再翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，3 d后更換培養(yǎng)液，2～3 d換液1次，細胞匯合至培養(yǎng)瓶80%時用0.05%的胰蛋白酶消化傳代。

1.3 免疫細胞化學(xué)染色hPDLP的表面抗體

取生長良好的第1代細胞制備細胞爬片,用SABC法染色進行波形絲蛋白Vimentin、角蛋白Keratin、STRO-1、CD146免疫組化染色，陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟不變，進行細胞來源及表達檢測，光鏡觀察。

1.4 流式細胞表型分析hPDLP的表面標(biāo)記

取對數(shù)生長期的第1～3代細胞，0.25%胰酶消化1min，1 000 r·min-1離心5min，棄上清液，調(diào)整細胞密度為每毫升1×106個，PBS洗2遍，加0.02mL的FCM緩沖液（含20 g·L-1牛血清白蛋白和0.1 g·L-1疊氮化鈉）重懸，PE標(biāo)記的STRO-1和FITC標(biāo)記的CD146抗體避光4℃孵育20min，加0.2mL PBS重懸，流式細胞儀上機檢測。

1.5 礦化誘導(dǎo)hPDLP

分別制備第1～3代和第8代hPDLP，接種到24孔板中，用10%FBS的DMEM培養(yǎng),待細胞伸展至60%匯合后，換礦化誘導(dǎo)液（含10mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50μg·mL-1維生素C、1×10-8mol·L-1地塞米松、10%FBS的DMEM培養(yǎng)液），每3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)21 d。鏡下觀察細胞復(fù)層生長并出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)，以4 g·L-1中性甲醛固定，采用von Kossa和茜素紅染色法進行礦化結(jié)節(jié)染色。

1.6 成脂誘導(dǎo)hPDLP和油紅O染色

分別制備第1代和第8代hPDLP，接種到24孔板中，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)，待細胞伸展至60%匯合后，換成脂誘導(dǎo)液（含1 mmol·L-1地塞米松，0.5mmol·L-1IBMX，100mg·L-1消炎痛，10mg·L-1胰島素，10%FBS的DMEM）誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，脂肪維持液（含10 mg·L-1胰島素和10%FBS的DMEM）培養(yǎng)1 d。經(jīng)過3次循環(huán)后，細胞再培養(yǎng)于脂肪維持液中1周，選擇2到3孔進行油紅O染色，其余的加Trizol分裝成1mL后存放至-70℃待用。

1.7 RT-PCR測定

為了進一步確認hPDLP經(jīng)誘導(dǎo)是否成功向成脂方向分化，在轉(zhuǎn)錄水平檢測相關(guān)基因過氧化物酶體激活物增生受體2（peroxisome proliferation activator receptor 2,PPARγ2）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）的表達，3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參。收集誘導(dǎo)前后的細胞，按Trizol Reagent說明書提取細胞中總RNA，用SuperScriptTMKit從提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，參照文獻合成下述引物進行RT-PCR檢測（表1），產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，通過灰度值分析進行半定量。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 Primers used for RT-PCR and sequencing reaction

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，LSD法兩兩比較各代之間STRO-1和CD146陽性率的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞生長情況

組織塊法原代培養(yǎng)的人牙周膜細胞3～6 d后，可見多個組織塊邊緣有細胞開始游出，細胞形態(tài)無明顯差別，大多數(shù)為長梭形成纖維狀，1～2個突起；少數(shù)為多角形、紡錘狀或橢圓形，體積較小，胞體豐滿，生長較快，約7～14 d開始匯合，以組織塊為中心呈放射狀、螺旋狀生長（圖1）。生長的細胞以1∶2傳代培養(yǎng)，最初5代的細胞培養(yǎng)3～5 d即可長滿培養(yǎng)瓶瓶底，生長狀態(tài)較活躍，核分裂象多見；6～12代細胞，培養(yǎng)7～10 d鋪滿，細胞增殖穩(wěn)定。

圖1 原代hPDLP培養(yǎng)10 d的生長狀態(tài) 倒置相差顯微鏡×40Fig 1 The primary hPDLP cell growth state by tissue cultured for 10 days inverted phase contrast microscope ×40

2.2 細胞表型鑒定

免疫組化顯示細胞波形絲蛋白染色陽性（圖2），角蛋白染色陰性。第1代牙周膜細胞中部分細胞抗STRO-1和CD146染色著色，細胞表達STRO-1和CD146強弱不等（圖3、4）。

2.3 流式細胞表型分析

流式細胞儀檢測第1～3代的hPDLP，STRO-1陽性率分別為4.23%±4.08%、1.92%±1.77%和0.44%± 0.24%，LSD法比較兩兩之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CD146陽性率分別為27.20%±3.98%、18.83%± 4.04%和10.61%±4.61%，LSD法比較兩兩之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 成骨誘導(dǎo)結(jié)果

礦化液連續(xù)培養(yǎng)10 d左右第1代細胞呈復(fù)層生長，明顯增厚，為局灶狀，中央出現(xiàn)許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高。15 d左右孔板底部出現(xiàn)肉眼可見的針尖大小灰白色小結(jié)節(jié)，并逐漸增大，21 d后行von Kossa和茜素紅染色可見大量染成棕褐色的片狀礦化結(jié)節(jié)，周邊界限不清（圖5）。

圖2 第1代hPDLP抗波形絲蛋白的陽性染色 SABC ×400Fig 2 Positive expression of Vimentin in the first generation of hPDLP SABC ×400

圖3 第1代hPDLP抗CD146染色的陽性染色 SABC ×400Fig 3 Positive expression of CD146 in the first generation of hPDLP SABC ×400

圖4 第1代hPDLP抗STRO-1的陽性染色 SABC ×400Fig 4 Positive expression of STRO-1 in the first generation of hPDLP SABC ×400

2.5 成脂誘導(dǎo)結(jié)果

第1代hPDLP經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，倒置顯微鏡下觀察，可見部分胞質(zhì)內(nèi)有大小不一的脂肪滴形成，經(jīng)油紅O染色脂滴染成紅色（圖6）。第8代牙周膜細胞經(jīng)脂肪誘導(dǎo)，倒置顯微鏡下雖也可見細胞胞質(zhì)內(nèi)有脂滴形成，但形成的量要明顯少于第1代細胞（圖7）。

圖5 hPDLP礦化誘導(dǎo)21 d后礦化結(jié)節(jié) 茜素紅染色 ×200Fig 5 Calcified nodules in the hPDLP cultured with mineralization induced medium for 21 d alizarin red staining ×200

圖6 第1代hPDLP成脂誘導(dǎo)21 d后脂滴形成 油紅O染色×400Fig 6 The formation of lipid droplets in the first generation of hPDLP cultured with adipogenic induction for 21 days oil red O staining ×400

圖7 第8代hPDLP成脂誘導(dǎo)21 d后脂滴形成 油紅O染色×400Fig 7 The formation of lipid droplets in the eighth generation of hPDLP cultured with adipogenic induction for 21 days oil red O staining ×400

RT-PCR結(jié)果表明在誘導(dǎo)的第1代細胞中存在轉(zhuǎn)錄，與預(yù)期條帶大小一致，在誘導(dǎo)的第8代細胞中不存在轉(zhuǎn)錄（圖8）。Tanon Gis圖像分析系統(tǒng)測定各細胞印跡條帶的灰度值，并進行半定量分析，將標(biāo)準條帶灰度值定為1，得到各條帶相應(yīng)灰度值。結(jié)果表明，未誘導(dǎo)第1代和誘導(dǎo)第8代細胞中不表達，誘導(dǎo)第1代細胞中表達。

圖8 hPDLP成脂誘導(dǎo)后RT-PCR檢測PPARγ2、LPL和GAPDH的mRNA表達Fig 8 The mRNA expression of PPARγ2,LPL and GAPDH of hPDLP cultured with induction medium by RT-PCR

3 討論

近年來,隨著成體干細胞研究的不斷深入，采用成體干細胞作為種子細胞運用于口腔組織工程的研究逐漸展開。牙周膜干細胞同其他組織的成體干細胞一樣，目前尚缺乏特異性的表面標(biāo)記對其進行鑒定和分離純化。Shi等[5]利用酶消化法通過有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化獲得PDLSC，采用直接組織塊法培養(yǎng)所得的細胞即為人牙周膜細胞群，首次對hPDLP和PDLSC的特性進行了對比研究，PDLSC細胞形態(tài)呈圓形或不規(guī)則形狀，周邊部細胞呈梭形或多角形，體積較小，部分細胞呈成纖維細胞狀，hPDLP主要為胞體較大的成纖維樣細胞和少量小而不規(guī)則形的細胞。hPDLP的概念逐漸明了，是含有干細胞成分的異質(zhì)性細胞群，但是對其多向分化潛能的研究在國內(nèi)外均少有報道。本實驗通過研究hPDLP多向誘導(dǎo)分化潛能，進一步探索hPDLP在體外是否具有干細胞群的特征。

本實驗通過組織塊法獲得的hPDLP主要為胞體較大的成纖維樣細胞和少量小而不規(guī)則形的細胞，提示分離的細胞可能由牙周膜成纖維細胞和不同分化階段的細胞共同組成，具有異質(zhì)性，這與Gay等[6]的研究結(jié)果相似。目前已有研究證實了分離純化的PDLSC具有成骨、成脂和成神經(jīng)分化的能力[4，7]，且在傳代過程中其增殖能力逐漸減弱，并可能喪失其多向分化潛能[8]。但是hPDLP是否具有干細胞的特性，在適當(dāng)?shù)臈l件和誘導(dǎo)因子作用下，能否向成骨細胞和成脂分化，在傳代過程中其多向分化能力是否逐漸減弱，目前在國內(nèi)未見相關(guān)報道。本實驗基于此假設(shè)，驗證hPDLP能否向成骨和成脂分化，采用分離培養(yǎng)的1～3代hPDLP進行了礦化和成脂分化的研究，同時對比了同一個樣本的第8代細胞的礦化和成脂的分化能力。

實驗中發(fā)現(xiàn)第1～3代和第8代hPDLP細胞在含β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松的礦化誘導(dǎo)液中, 10 d左右細胞呈復(fù)層生長，明顯增厚，為局灶狀，中央出現(xiàn)許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高，21 d后行von Kossa和茜素紅染色可見大量棕褐色的礦化結(jié)節(jié),周邊界限不清。體外礦化結(jié)節(jié)的形成情況能直觀地反映細胞的礦化能力，是細胞具備成骨、成牙骨質(zhì)特性的有力證據(jù)[9]。提示在傳代過程中hPDLP能夠保持礦化能力，并分泌礦化基質(zhì)。但是對于誘導(dǎo)礦化后的骨基質(zhì)相關(guān)蛋白標(biāo)志堿性磷酸酶、骨涎蛋白、骨鈣蛋白等的表達還有待進一步研究。

PDLSC具有多向分化的能力，具有高度的可塑性，不僅能分化成來源組織的細胞，而且還能轉(zhuǎn)向分化為不同胚層起源的細胞，這是對傳統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)觀點的革新。本實驗參照間充質(zhì)干細胞的常用誘導(dǎo)方法[4，6]，采用成脂誘導(dǎo)劑對hPDLP分化能力進行研究，表明可定向誘導(dǎo)為脂肪細胞，光鏡下可見第1～3代hPDLP細胞中有富集的脂質(zhì)小泡形成，油紅O染色明顯可見紅染的脂滴，RT-PCR結(jié)果也表明有脂肪形成的特異性基因PPARγ2和LPL的轉(zhuǎn)錄表達。這與其他學(xué)者研究結(jié)果相似。而第8代hPDLP經(jīng)過相同的誘導(dǎo)后雖然也出現(xiàn)了類似的變化，但是形成脂滴的量明顯少于第1代的hPDLP，RT-PCR顯示在誘導(dǎo)的第8代細胞中不存在相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。提示在傳代過程中hPDLP中的干細胞成分增殖能力逐漸減弱，并可能喪失其多向分化潛能。

STRO-1和CD146作為早期間充質(zhì)干細胞標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于間充質(zhì)干細胞的鑒定[10]。本實驗對分離培養(yǎng)的第1～3代hPDLP細胞進行了流式細胞表面抗體檢測，結(jié)果表明，CD146的陽性率各代之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時還對hPDLP細胞進行了STRO-1和CD146免疫組化染色。流式檢測數(shù)據(jù)和免疫組化染色結(jié)果提示，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞代數(shù)的增加，牙周膜細胞群中未分化的細胞亞型逐漸減少。研究[11]表明，干細胞在常規(guī)培養(yǎng)液中會發(fā)生分化，外胚間充質(zhì)細胞可出現(xiàn)自發(fā)分化，主要分化為成?。衫w維樣細胞。

本研究就hPDLP的橫向分化能力從礦化和成脂方向進行了研究，結(jié)果表明，第1～3代的hPDLP中含有一定比例的干細胞，在體外具有干細胞群的誘導(dǎo)分化能力。hPDLP的體外成功培養(yǎng)鑒定，將為后期研究牙周膜牙骨質(zhì)復(fù)合體的人工生物器官的構(gòu)建和牙周膜再生治療提供重要的理論依據(jù)。

[1] McCulloch CA.Progenitor cell populations in the periodontal ligament of mice[J].Anat Rec,1985,211（3）：258-262.

[2] Isaka J,Ohazama A,Kobayashi M,et al.Participation of periodontal ligament cells with regeneration of alveolar bone[J].J Periodontol,2001,72（3）：314-323.

[3] McCulloch CA,Nemeth E,Lowenberg B,et al.Paravascular cells in endosteal spaces of alveolar bone contribute to periodontal ligament cell populations[J].Anat Rec,1987,219（3）：233-242.

[4] Seo BM,Miura M,Gronthos S,et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J].Lanect,2004,364（9429）：149-155.

[5] Shi S,Huang GT,Gronthos S.Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.those from other sources：Their biology and role in regenerative medicine[J].J Dent Res,2009,88（9）：792-806.

[6] Gay IC,Chen S,MacDougall M.Isolation and characterization of multipotent human periodontal ligament stem cells[J].Orthod Craniofacial Res,2007,10（3）：149-160.

[7] Gronthos S,Shi S,Wang S,et al.Periodontal ligament stem cell-mediated treatment for periodontitis in miniature swine[J].Stem Cells,2008,26（4）：1065-1073.

[8] 孫蕾,朱慧勇.間充質(zhì)干細胞非分化性增殖的研究進展[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,36（2）：235-238.

SUN Lei,ZHU Hui-yong.Research progress of undifferentiated proliferation of mesenchymal stem cells[J].Int J Stomatol,2009, 36（2）：235-238.

[9] Wada Y,Kataoka H,Yokose T,et al.Changes in osteoblast phenotype during differentiation of enzymatically isolated rat calvaria cells[J].Bone,1998,22（5）：479-485.

[10] Gronthos S,Zannettino AC,Hay SJ,et al.Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derive from human bone marrow[J].J Cell Sci,2003,116（9）：1827-1835.

[11] 金巖.組織工程學(xué)原理與技術(shù)[M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社,2004：36-50.

JIN Yan.Principles and protocols of tissue engineering[M].Xi′an：The Fourth Military Medical University Press,2004：36-50.

（本文編輯 湯亞玲）

Differentiation characteristics of human periodontal ligament cell population in vitro

LIU Juan,ZHAO Hongyu,XUAN Dong-ying,XIE Bao-yi,ZHANG Jin-cai.（Dept.of Periodontology,Guangdong Provincial Stomatological Hospital,Southern Medical University,Guangzhou510280,China）

ObjectiveTo explore the multi-differentiated capability of human periodontal ligament cell population（hPDLP）,and provide a theoretical basis for the periodontal regeneration by tissue engineering technique.MethodshPDLP was cultured from periodontium of human tooth by the outgrowth method.STRO-1 and CD146 expression were investigated by flow cytometry.hPDLP was induced to odontogenic/osteogenic-like and adipogenic-like cell.The multilineage differentiation capacities of hPDLP were evaluated by alizarin red stain,oil red O stain,anti-CD146 and STRO-1 immunocytochemistry,and reverse-transcriptase polymerase chain reaction analysis.Results hPDLP was isolated from human periodontium and most of the cells retained their fibroblastic spindle shape.hPDLP can be induced into osteoblast-like cells and adipocyte-like cells,and calcium deposition and lipid droplets were detected perspectively.And the eighth generation of hPDLP had weaker potential into adipocyte-like cells than the first passage,however,there was no difference to the aspect of calcification ability between the two passages.ConclusionhPDLP culturedin vitrocan differentiate into adipocytes and osteoblasts,and the first to third passage cells may have the predominance of differentiation potential.

human periodontal ligament cell population； differentiation potential； calcification； induction

R 781.4

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.02.018

1000－1182（2010）02－0185-05

2009-01-07；

2009-07-05

廣東省科技計劃項目重大科技專項基金資助項目（2006-B35801010）

劉娟（1980—），女，河南人，碩士

章錦才，Tel：020-84232907