李 丹，王 貝，林奕婷，靳 冉，劉志文，劉選明

（湖南大學生物學院，生物能源與材料研究中心，湖南長沙 410082）

脫氧核酶（DNAzyme，DRz）是一種能特異性結合并切割靶RNA分子的酶性DNA，具有高效的催化降解能力和反義靶向識別能力［1］，被廣泛用于腫瘤、遺傳病等疾病的研究.脫氧核酶作為一種新型的靶基因沉默手段，其最主要的問題之一是如何有效地進入靶細胞.因此，尋找一種相容性好、在生物體內能夠穩(wěn)定遞送基因的材料在基因治療中具有廣泛應用的價值和意義.

作為殼聚糖的降解產物，殼寡糖（oligochitosan，COS）無毒、無副作用，具有生物粘附性、生物相容性和可降解性［2］.研究顯示，COS能保護DNA免于被DNase I降解，證明了COS應用于基因載體的可行性與安全性［3］.同殼聚糖這種生物大分子相比，COS還具有許多獨特的功能性質，如水溶性、抗菌性、抗腫瘤和免疫促進性等［4］.基于殼寡糖的納米藥物／基因遞送系統(tǒng)已成為藥物／基因治療研究的熱點之一.

EGFR是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一，在多種腫瘤組織中有高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和生物學行為密切相關，被認為是腫瘤基因治療的潛在理想靶點［5］.基于此，本文以COS為遞送載體，以靶向EGFR的脫氧核酶為研究對象，建立了一種有效的納米基因細胞內傳遞體系，并探討其介導的脫氧核酶在腫瘤細胞內的生物學效應.

1 材料與方法

1.1 材料

Hela細胞（ATCC－CCL－2）在10%小牛血清（Gibco BRL公司）的RPMI 1640培養(yǎng)基（賽莫飛世爾公司）中進行常規(guī)培養(yǎng).總RNA提取試劑TRIZOL和Taq酶等購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自安比奧.

1.2 EGFR脫氧核酶的設計與合成

由NCBI的GenBank獲取EGFR cDNA保守序列，按照文獻［6］方法進行靶向EGFR的脫氧核酶的設計和篩選，獲得序列EGFR－DRz：

上述序列由Invitrogen公司合成.其中，對序列的前后各三個堿基進行硫代磷酸化以增強其穩(wěn)定性.

1.3 COS－EGFR DRz復合物的制備與表征

COS（金殼生化）用1%的醋酸洗滌，0.22μm的濾網過濾，凍干，用PBS（pH6.5）配制成20mg／mL的溶液，過濾滅菌［7］.在水溶液中，COS分子表面帶正電荷，EGFR DRz分子表面帶有負電荷，利用靜電吸附加以震蕩可形成COS－EGFR DRz復合物.無菌條件下在1mL 1640培養(yǎng)基中分別加入不同比例的COS溶液和EGFR DRz，置于搖床震蕩10min即可.利用Zeta電位－粒度分析儀對COSEGFR DRz復合物的大小進行表征分析.

1.4 COS－EGFR DRz復合物的細胞轉染效率分析

選對數生長期的Hela細胞，用含抗生素的無血清培養(yǎng)基以105個細胞／孔接種于6孔板內培養(yǎng)過夜，分別以COS和脂質體oligofectmineTM（Invitrogen）為遞送載體，將FITC標記的EGFR DRz轉染細胞，24h后收集細胞，70%冷乙醇固定過夜.PBS洗2次，用流式細胞儀檢測帶熒光的細胞比例.

1.5 COS－EGFR DRz復合物在細胞內的分布

選對數生長期的Hela細胞，按照步驟1.4進行轉染，經過24h培養(yǎng)，D－Hanks清洗2次，DAPI染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察復合物在細胞內的分布情況.

1.6 COS－EGFR DRz復合物對EGFR mRNA的切割活性檢測

選對數生長期的Hela細胞，按照步驟1.4進行轉染.24h后提取總RNA，逆轉錄，用半定量PCR的方法檢測轉染前后EGFR mRNA水平的變化.其中，EGFR上游引物序列為：5’－ctt gca gcg ata cag ctc aga－3’；下游引物序列為：5’－tcc tgg tag tgt ggg tct ctg c－3’，擴增產物長度為189bp.β－actin上游引物序列為：5’–tta gct gtg ctc gcg cta ctc tct c－3’，下游引物序列為：5’–gtc gga ttg atg aaa ccc aga cac a－3’，擴增產物長度為168bp.10μL反應體系加入dNTPs，上、下游引物（20 μmol／L）各0.2μL和Taq酶（4U／μL）0.2μL.反應條件為94℃40s，60℃30s，72℃40s，35個循環(huán)，最后1個循環(huán)72℃10min.RT－PCR產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察.

1.7 COS－EGFR DRz復合物對細胞周期和細胞凋亡的影響

選對數生長期的Hela細胞，按照步驟1.4進行轉染.24h后70%乙醇固定過夜，PBS洗2次，流式細胞儀檢測細胞的周期分布和細胞凋亡.其中空白對照為不加任何轉染試劑的正常培養(yǎng)條件下的Hela細胞.

2 結果與討論

2.1 COS－EGFR DRz復合物表征分析

采用Zeta電位－粒度分析儀對COS－EGFR DRz復合物的穩(wěn)定性和粒徑進行分析.如圖1所示，固定EGFR DRz的濃度為2μmol／L，當復合物中COS的質量濃度為0.4mg／mL時，放置24h后，其粒徑沒有發(fā)生顯著變化，相對其他配比組要穩(wěn)定，在本實驗中我們選用此配比為最適配比.圖2顯示，脂質體包裹的EGFR DRz復合物粒徑在240nm左右，盡管COS－EGFR DRz復合物的粒徑略大，在500nm左右，但文獻顯示，當轉染復合物的粒徑在230～1 290nm范圍內時對其轉染效率沒有影響［8］.并且，目前也并沒有證據能直接證明粒徑與轉染率之間有相關性［9］.

圖1 COS質量濃度梯度對粒徑的影響Fig.1 The effect of COS concentration on nanoparticle size

圖2 不同載體復合物的粒徑分布圖Fig.2 The size analysis of different DRz／carrier complexes

2.2 COS－EGFR DRz復合物的細胞轉染效率分析

采用流式分析COS攜帶EGFR DRz進入細胞的遞送效率.如圖3所示，空白對照只有微弱的本底熒光，COS的轉染效率為88.7%，與脂質體的轉染效率（89.7%）非常接近.此外，當脂質體和COS共同轉染EGFR DRz時，其轉染效率在90%左右.結果表明COS是脫氧核酶的有效細胞內遞送載體.

圖3 流式細胞術對不同載體轉染效率的分析Fig.3 The transfection efficiency analysis of different carriers by Flow Cytometry

2.3 COS－EGFR DRz復合物在細胞內的分布

采用DAPI染色實驗進一步分析COS能否有效地遞送EGFR DRZ到細胞內.圖4是COS－EG－FR DRz復合物轉染Hela細胞后的激光共聚焦結果，綠色熒光是FITC標記的EGFR DRZ，可以看出經殼寡糖遞送的EGFR DRz成功地進入了細胞內，在細胞核與細胞質均有分布.并且，還可觀察到部分細胞染色質濃縮，呈現濃聚的藍色熒光，提示經EGFR DRz靶向識別的細胞發(fā)生了凋亡.

圖4 EGFR DRz在Hela細胞內的分布（500×）Fig.4 The distribution of EGFR DRz in Hela cell（500×）

2.4 COS－EGFR DRz復合物在腫瘤細胞內的切割活性分析

采用半定量RT－PCR進一步分析COS－EGFR DRz復合物能否有效地切割靶分子.從圖5可以看出，與無EGFR mRNA切割活性的control DRz相比，經脂質體或COS轉染的EGFR DRz能明顯導致EGFR mRNA表達水平降低，再次證實經COS遞送的EGFR DRz能夠有效地進入Hela細胞，并實現對靶基因的靶向切割活性.

圖5 COS－EGFR DRz復合物在Hela細胞內的切割活性分析Fig.5 The cleavage activity analysis of COS－EGFR DRz complexes in Hela cell

2.5 COS－EGFR DRz復合物對細胞周期和細胞凋亡的影響

許多腫瘤都有EGFR的過量表達，并使其下游信號途徑異常激活，最終導致細胞出現轉化、增殖等現象［10］.研究顯示，采用靶向EGFR基因的藥物，能有效抑制EGFR的表達，降低腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡［11－12］.如圖6所示，轉染EGFR DRz之后，G1期細胞比例均有所上升，細胞被阻滯在G0～G1期，這與EGFR基因沉默后細胞周期的表現一致［13］，證明細胞凋亡確實由EGFR DRz所致.結合圖7，在轉染效率相似的條件下，COS組轉染EGFR DRz的細胞凋亡率達到19.3%，高于脂質體組的13%，進一步證實了COS作為基因載體的有效性，也表明COS本身對腫瘤細胞的生長也有一定的抑制作用.此外，當遞送control DRz時，COS組的凋亡率2.49%，僅為脂質體組5.97%的一半，說明COS對細胞的毒性比脂質體更低.

圖6 流式細胞術分析細胞周期Fig.6 Cell cycle analysis by Flow Cytometry

圖7 流式細胞術分析細胞凋亡Fig.7 Cell apoptosis analysis by Flow Cytometry

3 結 論

近年來，基于可生物降解的大分子多聚體的藥物／基因遞送系統(tǒng)的研究已成為生物醫(yī)學領域的研究熱點之一.殼寡糖作為一種天然的可生物降解的聚合物，來源豐富，理化性質相對穩(wěn)定，具有多種生物學活性，已成為被廣泛關注的生物醫(yī)學材料.本文設計合成了靶向EGFR的脫氧核酶，以殼寡糖為遞送載體，轉染Hela細胞，有效地實現了EGFR DRz的細胞內遞送和對目的基因的靶向切割.與經典轉染試劑脂質體相比，殼寡糖不但具有與脂質體相同的轉染效率，并由于其本身具有抗腫瘤作用，因而對細胞的毒性更低.因此，殼寡糖作為一種潛在的、有效的脫氧核酶遞送載體，不僅為基因治療提供了一種新的手段，同時其本身所具有的多種生物學特性也豐富了藥物／基因載體所發(fā)揮的作用.

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