馬瑞娜 綜述 崔鵬程 審校

喉全切除后理想的重建方法是喉移植。早在1965年就有關(guān)于狗喉再植模型的研究。1969年，Klausken等對(duì)一位喉癌患者施行部分喉移植術(shù)，手術(shù)本身是成功的，患者術(shù)后在恢復(fù)發(fā)聲、呼吸、吞咽功能的同時(shí)也取得了較好的美容效果，但術(shù)后8個(gè)月患者死于腫瘤復(fù)發(fā)。在隨后的20年中由于技術(shù)和免疫排斥問(wèn)題以及倫理學(xué)的爭(zhēng)論，使喉移植的發(fā)展落后于其它實(shí)質(zhì)性臟器的移植。近年來(lái)隨著免疫生物學(xué)的發(fā)展及免疫抑制劑的研究，喉移植逐漸成為患者改善生活質(zhì)量的迫切需求。1998年Strome等[1]完成了人類(lèi)歷史上第一例喉移植，該患者在隨后7年多能正常吞咽，發(fā)聲基本正常，頸部外觀美容效果好，有較高的生活質(zhì)量[2]。喉移植無(wú)論在發(fā)聲、呼吸、美容、生活質(zhì)量等方面均優(yōu)于目前喉全切除后的其它重建方法。然而由于人喉黏膜不僅血運(yùn)豐富,而且富含免疫組織及免疫細(xì)胞,移植后的排斥反應(yīng)始終是一個(gè)難題。本文就喉移植免疫學(xué)方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 喉移植免疫調(diào)節(jié)

1.1喉的免疫原性 近年來(lái)對(duì)人[3～5]以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[6，7]的研究表明喉包含有免疫組織，這種組織以喉相關(guān)性淋巴上皮濾泡的形式存在，其表達(dá)與年齡和疾病相關(guān)，并呈彌散分布，這種免疫結(jié)構(gòu)對(duì)外界環(huán)境的變化反應(yīng)迅速。在對(duì)大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)病毒、細(xì)菌及其誘導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)均可引起這種免疫組織快速反應(yīng)，導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞大量增殖[8，9]。同種異體移植物存活的關(guān)鍵主要依賴(lài)于供體主要組織相容性抗原復(fù)合物(major histocompability complex，MHC)的表達(dá)，供體的淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等具有豐富的MHCⅠ、Ⅱ類(lèi)抗原，是主要的致敏原，排斥反應(yīng)發(fā)生的快慢和嚴(yán)重程度取決于供、受體組織相容性的匹配程度[10]。Rees等[5]通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)人的喉黏膜，結(jié)果顯示喉的上皮組織及黏膜含有MHC抗原，并認(rèn)為喉黏膜具有免疫活性，可能會(huì)引起喉移植急性排斥反應(yīng)。Edward等[11]研究發(fā)現(xiàn)人喉的人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)在各種組織中分布不同，人喉的黏膜層高表達(dá)HLAI，中度表達(dá)HLAⅡ；黏膜下腺層高表達(dá)HLAⅡ，中度表達(dá)HLAI；甲狀軟骨和甲狀腺中僅高表達(dá)HLAI；在軟骨膜和雪旺細(xì)胞中均可見(jiàn)HLAI和HLAⅡ表達(dá)，但HLAI表達(dá)強(qiáng)于HLAⅡ；軟骨基質(zhì)、肌細(xì)胞、神經(jīng)軸突既不表達(dá)HLAI也不表達(dá)HLAⅡ。MHCⅡ是啟動(dòng)免疫排斥的主要抗原，在喉組織中主要分布在黏膜上皮層、黏膜下腺、血管、軟骨膜和雪旺細(xì)胞。根據(jù)淋巴細(xì)胞表面分化抗原(cluster of differentiation, CD)及功能的不同將淋巴細(xì)胞分為若干亞群，在免疫排斥中，MHCI和 MHCⅡ抗原都需要CD4的參與，CD8在被活化前由CD8與CD4共同識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞表面的異體的MHC[12]，CD8+T細(xì)胞的T細(xì)胞受體/CD3復(fù)合物(TCR/CD3)識(shí)別外來(lái)抗原與MHCI類(lèi)抗原(多肽部分)的復(fù)合物，介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)抗原進(jìn)行排斥。 CD4+T細(xì)胞中的TCR/CD3識(shí)別外來(lái)抗原與MHCⅡ類(lèi)抗原(多肽部分)的復(fù)合物，激活TH1和TH2細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞活化。樹(shù)突狀細(xì)胞是最重要的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，具有強(qiáng)烈的激活T細(xì)胞的能力，這些細(xì)胞分散在除了腦組織和角膜之外的全身各個(gè)組織中，是全身免疫系統(tǒng)的監(jiān)視細(xì)胞，在移植后的排斥反應(yīng)中具有重要作用。Jecker 等研究表明大鼠的APC 主要存在于喉黏膜上,這一結(jié)論在其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如豬的實(shí)驗(yàn)研究中也得到證實(shí)[7,13]。Friedman等[14]發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞主要存在于上皮細(xì)胞中，喉上皮組織中樹(shù)突狀細(xì)胞的分布密度最高，上皮下層樹(shù)突狀細(xì)胞的密度僅為上皮層的25%。除了聲門(mén)處密度較低以外，樹(shù)突狀細(xì)胞沿著喉氣管下行，密度逐漸增高，軟骨組織中沒(méi)有樹(shù)突狀細(xì)胞的分布，喉的非黏膜組織與黏膜組織相比僅具有很低密度的樹(shù)突狀細(xì)胞，喉的黏膜組織是免疫排斥反應(yīng)的靶細(xì)胞。在一些器官移植的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，組織缺血再灌注后會(huì)引起主要組織相容性抗原表達(dá)上調(diào)，從而會(huì)增加移植物的免疫原性[15]。Barker等[13]在對(duì)豬的喉移植模型的研究中發(fā)現(xiàn)聲門(mén)上區(qū)缺血再灌注后免疫活性細(xì)胞數(shù)量減少，聲門(mén)下區(qū)缺血再灌注后免疫活性細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。總之，在不同樣本間免疫細(xì)胞活性的表達(dá)更取決于個(gè)體的差異性而不是以上所說(shuō)的這些部位改變。因此，這種發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)意義也受到了質(zhì)疑。

1.2免疫排斥反應(yīng)的分級(jí)和標(biāo)志 Strome等[16]研究的喉移植模型不僅包括喉，還包括甲狀腺、甲狀旁腺等。早在1992年，他們對(duì)大鼠喉移植模型的研究發(fā)現(xiàn)喉急性免疫排斥反應(yīng)一般開(kāi)始于術(shù)后24小時(shí)，最早是黏膜水腫、白細(xì)胞滲出，接著是大量淋巴細(xì)胞滲出，進(jìn)行性的上皮組織、腺體、肌肉以及骨骼破壞，14天后移植喉出現(xiàn)完全的破壞，最終被肉芽組織取代。Lorenz等[17]將大鼠喉移植后免疫排斥按照移植的時(shí)間和供體喉植入后不同組織的變化分為未見(jiàn)排斥(24小時(shí)內(nèi))、輕度排斥(3天)、中度排斥(5～7天)、中重度排斥(9～12天)、重度排斥(15～20天)5個(gè)等級(jí)。在對(duì)同種異體移植喉樣本的各種組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)上皮組織的排斥反應(yīng)最明顯，移植后1周左右即有大部分復(fù)層上皮已經(jīng)排斥得只剩單層上皮，而到15～20天時(shí)，已經(jīng)檢測(cè)不到上皮組織；肌肉組織是另一類(lèi)免疫排斥較明顯的組織，肌肉在移植后1周左右即已經(jīng)排斥掉一半，而在15～20天時(shí)已完全缺失；小唾液腺在移植后1天即發(fā)生水腫，5～7天左右發(fā)生萎縮，而7～10天時(shí)已經(jīng)完全被排斥掉；淋巴濾泡在移植后3天少有腫脹，5～7天時(shí)較明顯，9～12天時(shí)體積變??；甲狀腺在移植3天時(shí)已開(kāi)始發(fā)生排斥反應(yīng)，5～7天時(shí)已經(jīng)被排斥掉一半以上，9～12天后已經(jīng)完全被排斥掉；軟骨膜的免疫排斥反應(yīng)較以上組織弱，在9～12天時(shí)仍有大部分軟骨膜存在，而15～20天時(shí)還有一半軟骨膜存在；軟骨的免疫原性是最弱的，在9～12天時(shí)未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，軟骨結(jié)構(gòu)正常，15～20天時(shí)僅有少量軟骨組織減少，大部分結(jié)構(gòu)仍存在。Nelson等[18]將甲狀旁腺素(parathyroid hormone ，PTH)作為免疫排斥的生物學(xué)標(biāo)志，根據(jù)Strome等[16]研究的喉移植模型，在大鼠同種異體移植術(shù)前對(duì)受體實(shí)施甲狀旁腺切除術(shù)，移植術(shù)后24小時(shí)發(fā)現(xiàn)受體體內(nèi)甲狀旁腺素重新達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化水平，并且隨著免疫排斥的進(jìn)行開(kāi)始下降，甲狀旁腺組織學(xué)的變化與移植喉組織免疫排斥反應(yīng)組織學(xué)的變化相一致，因此認(rèn)為，PTH可以作為喉移植急性排斥反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志。陳剛等[19]在對(duì)大鼠喉移植的研究中發(fā)現(xiàn)移植組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及白細(xì)胞介素10(interleukin 10, IL-10)表達(dá)水平的變化與排斥反應(yīng)的密切程度相關(guān)，TNF-α是介導(dǎo)喉移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子；IL-10在喉移植免疫耐受中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。TNF-α能有效地反映免疫排斥反應(yīng)的程度，而IL-10則是反映免疫耐受的有效指標(biāo)。TNF-α及IL-10能夠反映移植組織排斥反應(yīng)進(jìn)程的變化。

2 降低免疫排斥的對(duì)策

理想的降低移植排斥措施是進(jìn)行同基因型喉移植，在MHC配型吻合的人群中進(jìn)行移植有諸多優(yōu)越性，但尋找MHC配型吻合的供體較為困難，限制了其臨床應(yīng)用。常用的降低免疫排斥的措施有：應(yīng)用免疫抑制劑，誘導(dǎo)受體免疫耐受，降低喉的免疫原性。

2.1免疫抑制劑的應(yīng)用 限制喉移植臨床應(yīng)用的主要問(wèn)題是免疫抑制劑的使用，尋求一種既能誘導(dǎo)免疫耐受同時(shí)副作用又小的免疫抑制劑是今后的發(fā)展方向之一。環(huán)胞素A(cyclosporin A，CsA)的應(yīng)用開(kāi)創(chuàng)了抑制排斥反應(yīng)的新局面。由于CsA 有效地抑制了抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及慢性炎癥，已成為免疫抑制療法的主要用藥。Strome[16]通過(guò)應(yīng)用CsA對(duì)大鼠同種異體喉移植的研究表明，CsA應(yīng)用劑量與移植物的組織學(xué)變化成負(fù)相關(guān)。CsA用量小(5 mg-1·kg-1·d-1)時(shí), 移植喉的組織學(xué)表現(xiàn)為中到重度排斥反應(yīng);CsA劑量為7.5 mg-1·kg-1·d-1時(shí),組織學(xué)表現(xiàn)為輕到中度排斥反應(yīng);應(yīng)用大劑量CsA(10 mg-1·kg-1·d-1)的組織學(xué)僅表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 黏膜和黏膜下腺體結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常,說(shuō)明CsA有抑制喉同種異體移植免疫排斥反應(yīng)的作用。CsA的主要副作用是腎毒性，類(lèi)固醇能夠減少環(huán)胞霉素A到2 mg/kg,在減少CsA用量的同時(shí)減小了CsA的副作用，而免疫抑制作用未受明顯影響[20]。Berke等(1965)在對(duì)犬進(jìn)行同種異體喉移植的實(shí)驗(yàn)中,將CsA、硫唑嘌呤、甲基強(qiáng)的松和強(qiáng)的松聯(lián)合應(yīng)用，證實(shí)可延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間，聲帶功能恢復(fù)良好，組織學(xué)檢查基本正常。Nelson等[21]將他可莫林單獨(dú)或與麥考酚脂聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)麥考酚脂能夠提高他可莫林的耐藥性，同時(shí)減少他可莫林的劑量。Akst等[22]將他莫克林與抗T細(xì)胞α、β受體的單克隆抗體聯(lián)用，持續(xù)5天，結(jié)果10例大鼠中有8例在術(shù)后的100天內(nèi)在組織學(xué)上未出現(xiàn)強(qiáng)烈的免疫排斥，但是100天后，受體的免疫系統(tǒng)逐漸恢復(fù)，發(fā)生排斥反應(yīng)。Khariwala等[23]在這種受體出現(xiàn)免疫恢復(fù)的時(shí)候，再次應(yīng)用上述短期沖擊療法，取得了滿(mǎn)意的效果。這種短期應(yīng)用免疫抑制劑方法的好處在于避免了長(zhǎng)期應(yīng)用所產(chǎn)生的副作用。

2.2誘導(dǎo)移植物的免疫耐受 誘導(dǎo)嵌合體形成是最古老的誘導(dǎo)免疫耐受的方法。嵌合狀態(tài)即兩種來(lái)源不同的細(xì)胞群在一個(gè)機(jī)體內(nèi)共同存在的狀態(tài)，對(duì)移植物的長(zhǎng)期存活具有重要意義。供體骨髓輸注移植術(shù)已經(jīng)被成功的應(yīng)用于人的實(shí)質(zhì)臟器移植以提高受體的嵌合狀態(tài)。在大鼠喉移植中，Khariuala等[24]對(duì)移植術(shù)后靜脈輸注骨髓和在喉移植同時(shí)接受同一供體血管化骨移植這兩種方法進(jìn)行研究，雖然兩種方法喉移植術(shù)后受體存活均可超過(guò)180天，但均未能檢測(cè)到嵌合體，血管化骨移植組混合淋巴細(xì)胞檢測(cè)并沒(méi)有顯示特殊的免疫耐受，嵌合狀態(tài)小于1%。這種結(jié)果與實(shí)質(zhì)臟器移植結(jié)果不同，可能是免疫抑制劑應(yīng)用時(shí)間的限制尚未使受體外周血中形成供體細(xì)胞。雖然目前其他領(lǐng)域已有臨床應(yīng)用嵌合體誘導(dǎo)免疫耐受的經(jīng)驗(yàn),但仍需進(jìn)一步研究其可行性及建立成熟的評(píng)價(jià)體系。

2.3降低移植喉的免疫原性 喉是由甲狀軟骨、環(huán)狀軟骨、杓狀軟骨、肌肉、黏膜和關(guān)節(jié)等構(gòu)成的復(fù)合組織器官，具有很強(qiáng)的免疫原性，采用直接的同種異體移植術(shù)必然會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致移植的失敗，而大量使用免疫抑制劑會(huì)造成原有腫瘤復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移，多重感染等嚴(yán)重后果(Lepold,1983)。 Barthel等[25]認(rèn)為在移植前對(duì)供體喉進(jìn)行7.34 Gy 左右的體外照射,可減少環(huán)孢素的用量,有一定的免疫抑制作用。但Lorenz等[20]認(rèn)為對(duì)移植喉進(jìn)行體外照射只是增加了受體對(duì)免疫抑制劑的攝取，并未降低移植物的免疫原性。也有學(xué)者認(rèn)為移植前對(duì)受體進(jìn)行預(yù)防性照射,可顯著減少移植后的排斥反應(yīng)[26]。通過(guò)組織工程技術(shù)獲得異體的少量組織，在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)滅菌、消化、分離、培養(yǎng)等可降低免疫排斥反應(yīng)，如Yamashita等[27]利用聚丙烯網(wǎng)復(fù)合豬皮膚膠原基質(zhì),成功修補(bǔ)犬的半喉，Xu等[28]通過(guò)高滲鹽、核酸酶消化及乙醇脫水處理后制備出牛聲帶細(xì)胞外基質(zhì)，侯楠等[29]運(yùn)用灌注法制備出了兔低免疫原性全喉支架，這種支架在保留了軟骨活性的同時(shí)提供了較完整的去細(xì)胞全喉支架,但其應(yīng)用于臨床還需進(jìn)一步的研究。

隨著器官移植學(xué)的飛速發(fā)展，非生命必須器官的移植受到人們的重視，盡管喉移植的免疫抑制方法還有待進(jìn)一步完善，但是隨著該領(lǐng)域研究的不斷深入，喉移植將成為人類(lèi)治療喉全切除術(shù)后喉功能重建的新選擇。

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