蔣 穎綜述 韋云飛 秦 超審校

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,南寧市 530021)

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病,為不同病因引起的一組腦功能障礙性疾病和綜合征,他以腦部神經(jīng)元異常過(guò)度放電所致的突發(fā)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)失常為特征,常常反復(fù)發(fā)作。癲癇藥物為癲癇患者帶來(lái)了福音,由于受病理特性、抗癲癇藥物使用不當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊?目前,仍有 20%～40%患者發(fā)展成為難治性癲癇[1]。目前,難治性癲癇(IE)的定義為:3～4年以上的癲癇病程;每月至少有 4次以上的癲癇發(fā)作;經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期系統(tǒng)的多種抗癲癇藥治療,即使在血藥濃度檢測(cè)下也不能控制癲癇發(fā)作,且因癲癇發(fā)作頻繁,嚴(yán)重致殘,影響學(xué)習(xí)、工作和生活者。

1 多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體

近年的研究認(rèn)為,IE的發(fā)生與腦內(nèi)多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)增多導(dǎo)致多種抗癲癇藥物在腦組織內(nèi)濃度降低有關(guān)。目前多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體抗癲癇藥物耐藥機(jī)制研究的熱點(diǎn)有多藥耐藥基因(MDR)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、穹窿主蛋白(MVP)等。

1.1 MDR MDR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的與難治性癲癇有關(guān)的耐藥基因。人類的 MDR位于染色體的第 7號(hào)長(zhǎng)臂,有 28個(gè)外顯子,可以轉(zhuǎn)錄 4.5kb的 mRNA。人類 MDR基因由 MDR 1和MDR 2組成,MDR 1起主要作用,編碼一種相對(duì)分子質(zhì)量為170×103的細(xì)胞膜所固有的一類跨膜磷脂糖蛋白,即 P-糖蛋白(Pgp)。Pgp的整個(gè)分子有 2個(gè)幾乎相等的半部由鏈區(qū)連接,每個(gè)半部含 6個(gè)疏水跨膜區(qū)及一個(gè)短的親水氨基酸末端,有 2個(gè) ATP結(jié)合位點(diǎn),在 ATP供能的前提下通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式將親脂性藥物泵出細(xì)胞外,具有 ATP依賴性藥泵的作用[2]。Pgp的生理功能主要是降低細(xì)胞內(nèi)、外毒物的積累量,或改變藥物在胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布而保護(hù)機(jī)體,構(gòu)成機(jī)體重要的生理防線以抵抗外來(lái)藥物及毒物。生理?xiàng)l件下,Pgp廣泛表達(dá)于在與排泄有關(guān)的組織器官中,如肝臟、腎臟、小腸及血 -組織屏障,如血腦屏障及血胎盤屏障,在腦組織的神經(jīng)膠質(zhì)及神經(jīng)元中無(wú)表達(dá)。相關(guān)難治性癲癇的研究表明,神經(jīng)系統(tǒng)異常表達(dá)的 Pgp廣泛分布在腦實(shí)質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞、腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上。

在臨床研究中,丁成云等[3]應(yīng)用免疫組化和免疫組化雙標(biāo)記技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),IE患者腦組織中MDR 1蛋白的表達(dá)主要在一些增生性星形膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管壁周圍結(jié)構(gòu),而寡突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及正常的神經(jīng)元內(nèi)無(wú)MDR 1蛋白的表達(dá);增生性星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) MDR蛋白與膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)具有共存現(xiàn)象。Tisher等[2]用免疫組化和定量轉(zhuǎn)錄酶PCR分析 19例手術(shù)切除的 IE患者腦組織中 MDR 1表達(dá)和Pgp的變化,同時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi) PHT的濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有 11例患者M(jìn)DR mRNA水平超出正常的 10倍,14例患者 Pgp在毛細(xì)血管內(nèi)皮中染色較正常腦組織增強(qiáng);Domobrowski等[4]用 cDNA基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)研究 IE患者顳葉內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn) MDR呈過(guò)度表達(dá)且Pgp水平顯著高于對(duì)照組。鄭學(xué)平等[5]采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)半定量檢測(cè)外周血中 MDR 1基因mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示難治性癲癇患者(全面性強(qiáng)直一陣攣發(fā)作癲癇、部分性發(fā)作癲癇、失神發(fā)作癲癇)外周血中MDR 1基因mRNA的表達(dá)。

在動(dòng)物模型的研究中,肖爭(zhēng)等[6]用苯妥英鈉和苯巴比妥篩選單側(cè)杏仁核點(diǎn)燃大鼠模型,6周后免疫組化檢測(cè)耐藥組和有效組大鼠腦組織MDR 1的表達(dá)產(chǎn)物Pgp,顯示杏仁核、顳葉、額葉、頂葉等除小腦外的腦區(qū),耐藥組Pgp的表達(dá)均顯著高于有效組,且耐藥組星型膠質(zhì)細(xì)胞的Pgp表達(dá)更顯著;Rizzi等[7]用RT-PCR檢測(cè)海人酸點(diǎn)燃大鼠MDR 1基因mRNA及Pgp表達(dá),在海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)分別提高 1.8倍和 5倍。Volk等[8]通過(guò)制作杏仁核電點(diǎn)燃癲癇大鼠模型,在完全點(diǎn)燃 8 h大鼠腦組織免疫組化結(jié)果顯示,IE模型鼠邊緣系統(tǒng)包括海馬神經(jīng)元Pgp的表達(dá)比非耐藥組顯著增多。

1.2 MRP MRP是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的多基因家族,目前研究共發(fā)現(xiàn) MRP多基因家族 7個(gè)基因:MRP1～MRP7,其中 MRP1與 IE的耐藥關(guān)系最密切。MRP1是一種與 ATP結(jié)合的相對(duì)分子量為 190×103的磷酸化糖蛋白,由 1 531個(gè)氨基酸組成。MRP含 3個(gè)反復(fù)穿膜的疏水跨膜區(qū)和 2個(gè)核苷酸結(jié)合功能區(qū),其中含 2個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn),通過(guò)水解 ATP供能主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)相應(yīng)的底物。生理?xiàng)l件下,MRP主要表達(dá)在肺、肝細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞、腎小管、睪丸等正常組織的細(xì)胞質(zhì)中,異常表達(dá)的MRP主要過(guò)度表達(dá)在細(xì)胞膜上[9,10]。MRP與 Pgp一樣通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)逆濃度梯度將疏水化合物泵出細(xì)胞,藥物外排增加,藥物在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布降低,導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。

在臨床研究中,Kubota等[11]發(fā)現(xiàn)由海馬硬化引起的 IE患者海馬及齒狀回的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上 Pgp呈過(guò)度表達(dá),MRP1表達(dá)在齒狀回實(shí)質(zhì)細(xì)胞,MRP2表達(dá)在海馬內(nèi)皮細(xì)胞,并用 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn) IE患者 MDR1、MRP1、MRP5、MRP6的mRNA水平較正常對(duì)照組顯著增高。Lazarowski等[12]應(yīng)用免疫組化及單克隆抗體技術(shù)研究結(jié)節(jié)性硬化患者腦組織,發(fā)現(xiàn)在氣球樣細(xì)胞、發(fā)育不良的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等上均有 MDR 1、MRP1的高表達(dá)。

在動(dòng)物模型的研究中,vanVliet等[13]研究電刺激慢性癲癇大鼠模型中發(fā)現(xiàn),癲癇持續(xù)狀態(tài)后,Pgp、MRP1、MRP2過(guò)度表達(dá)在邊緣結(jié)構(gòu)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞上,尤其在血管和血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞。Hoffmann等[14]研究 MRP基因敲除的小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織中苯巴比妥濃度明顯高于野生型小鼠。

1.3 MVP 近年來(lái),一種 1993年最初從非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥蛋白,即MVP也成為難治性癲癇研究的熱點(diǎn),MVP在腫瘤耐藥中的主要作用機(jī)制表現(xiàn)為將藥物從細(xì)胞內(nèi)的特定靶點(diǎn)中轉(zhuǎn)出,其是否會(huì)以相同方式參與到難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制中引起大家的關(guān)注。Aronica等[15]2003年對(duì) 30例經(jīng)外科手術(shù)治療的由神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤引發(fā)難治性癲癇的患者進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在全部 30例腦組織標(biāo)本中均可檢測(cè)到 MVP的表達(dá)程度較對(duì)照組有明顯升高。Sisodiya等[16]在對(duì)難治性癲癇患者進(jìn)行研究時(shí)也發(fā)現(xiàn),在海馬硬化、局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良以及胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤的異常神經(jīng)元中MVP存在過(guò)度表達(dá)。但 MVP的相關(guān)研究較少,MVP在難治性癲癇中的作用機(jī)制至今仍不明確,有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

2 難治性癲癇的動(dòng)物模型

由于癲癇患者腦組織取材困難,即使獲取標(biāo)本,在離體腦組織上模擬發(fā)作的真實(shí)情況也極為不易,而在患者身上研究IE的發(fā)生機(jī)制也比較困難,因而考慮建立 IE模型,利用 IE模型探討其形成和耐藥機(jī)制以及篩選新的抗癲癇藥物。難治性癲癇動(dòng)物模型建立的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[17]:①一線的抗癲癇藥物不能控制其癲癇發(fā)作;②模型發(fā)作時(shí)有腦部異常放電,可從電生理角度評(píng)價(jià)藥物療效;③發(fā)作類型應(yīng)與臨床類型相似,即復(fù)雜部分性發(fā)作繼發(fā)全身性發(fā)作 ;④能夠長(zhǎng)期存活,可進(jìn)行抗癲癇藥物的長(zhǎng)期研究。

2.1 遺傳性癲癇動(dòng)物模型 遺傳性癲癇動(dòng)物癇性發(fā)作在癲癇行為、電生理和生化改變上與人類接近。研究發(fā)現(xiàn),有的動(dòng)物本身具有癲癇先天易感性[17],其中,有先天性聲源性敏感小鼠、光敏性雛雞、光敏感狒狒等,其反射性、易感性在人類少見(jiàn),不適合制作 IE模型。有的可以通過(guò)基因打靶制成的轉(zhuǎn)基因癲癇模型,或是通過(guò)理化和放射線使其皮層發(fā)育畸形而對(duì)癲癇易感,但轉(zhuǎn)基因模型制作復(fù)雜,價(jià)格昂貴,且植入基因在不同載體基因背景下表型不同,與皮層畸形模型一樣不易出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作,國(guó)內(nèi)目前較少用于IE模型的研究。遺傳性癲癇狗部分性發(fā)作類似于人類難治性癲癇表現(xiàn),但因胃腸蠕動(dòng)快和絕大多數(shù) AED在狗體內(nèi)被迅速代謝,研究所需時(shí)間內(nèi)無(wú)法保持有效的血藥濃度。小鼠為遺傳性局灶性發(fā)作的模型,但其發(fā)作頻率不規(guī)范,不適合用于IE的研究。遺傳性癲癇易感大鼠對(duì)部分傳統(tǒng)抗癲癇藥有效,不適合作 IE的動(dòng)物模型研究。

2.2 點(diǎn)燃模型 目前,應(yīng)用最廣泛的癲癇模型為點(diǎn)燃模型,其發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與人類癲癇的發(fā)病機(jī)制相似。根據(jù)刺激方法,點(diǎn)燃模型主要有電點(diǎn)燃和化學(xué)點(diǎn)燃。點(diǎn)燃不僅可進(jìn)行性提高發(fā)作敏感性,還可以引起腦功能改變,是現(xiàn)在公認(rèn)的難治性癲癇的理想模型。

2.2.1 電點(diǎn)燃模型 電點(diǎn)燃是以同等強(qiáng)度的閾下刺激,在一定的時(shí)間間隔下重復(fù)刺激動(dòng)物邊緣腦區(qū)的某一部位,使癲癇活性強(qiáng)度逐漸增加,最終出現(xiàn)全面性癲癇發(fā)作。最常見(jiàn)的電點(diǎn)燃部位有杏仁核,其次是新皮質(zhì)區(qū)和海馬[18]。由于,對(duì)電刺激最敏感,目前用于難治性癲癇研究的主要有杏仁核點(diǎn)燃模型。電點(diǎn)燃杏仁核引起的自發(fā)性邊緣系統(tǒng)癲癇與人類顳葉癲癇在癥狀學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)和行為學(xué)缺陷等方面均很相似,并且模型穩(wěn)定性好,致癇效應(yīng)相對(duì)持久,點(diǎn)燃狀態(tài)一旦形成可以持續(xù)至少數(shù)月,繼續(xù)刺激還可形成自發(fā)性癲癇,重復(fù)誘發(fā)率高,發(fā)作行為可控性好,誘發(fā)需要的刺激次數(shù)、行為級(jí)數(shù)、后放電閾值、后放電時(shí)程等均可作為定量研究的依據(jù),是一種較理想的IE動(dòng)物模型。但缺點(diǎn)主要是制作復(fù)雜、動(dòng)物不易飼養(yǎng)、容易死亡等。

2.2.2 化學(xué)點(diǎn)燃模型 化學(xué)點(diǎn)燃是反復(fù)給予低于抽搐劑量的藥物誘發(fā)逐漸加重的癲癇發(fā)作,用在腦內(nèi)或全身性注射進(jìn)行點(diǎn)燃的有海人酸(kainic acid,KA)、青霉素、戊四氮、美解眠、匹魯卡品等。青霉素點(diǎn)燃可用于誘發(fā)全面性癲癇發(fā)作和失神發(fā)作的模型;戊四氮和美解眠可誘發(fā)急性全身性發(fā)作的模型,但易于被AED控制,不適合制作難治性癲癇模型;匹魯卡品可誘發(fā)復(fù)雜部分發(fā)作繼發(fā)全身性發(fā)作的模型?，F(xiàn)在應(yīng)用最廣泛的化學(xué)點(diǎn)燃模型有 KA,KA點(diǎn)燃的復(fù)雜部分發(fā)作模型是一種較理想的難治性癲癇動(dòng)物模型,可局部腦室、海馬、杏仁核給藥或全身給藥,KA模型制作比較簡(jiǎn)單,發(fā)作時(shí)與人類顳葉癲癇的行為特點(diǎn)相似,神經(jīng)病理學(xué)研究上發(fā)現(xiàn)模型的神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、苔蘚纖維絲狀芽生等與人類顳葉癲癇相似,KA模型對(duì)大部分抗癲癇藥物耐藥,已廣泛應(yīng)用于難治性癲癇耐藥機(jī)制的研究中,但 KA模型對(duì)癲癇灶的控制及預(yù)測(cè)癲癇發(fā)作較電刺激模型差,在難治性癲癇研究中有一定限制。

3 展 望

目前,對(duì)于難治性癲癇的研究多局限在針對(duì)手術(shù)切除的腦組織及動(dòng)物模型的癲癇腦組織上,一定程度上限制了臨床實(shí)踐,因此尋求客觀的外周指標(biāo),有利于協(xié)助難治性癲癇在臨床中的診治[19,20]。而理想的模擬人類各種類型癲癇發(fā)作的動(dòng)物模型,為今后的臨床研究打下堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上,有望較早的發(fā)現(xiàn)難治性癲癇患者,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄藥物,提高難治性癲癇的治療成功率,給患者帶來(lái)福音。

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