張國欣 徐金升 阮琳 薛蘭芬 聶麗敏 潘志蘭 牛文明

糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是還原糖(如葡萄糖、果糖及葡萄糖-6-磷酸等酮糖)與蛋白質(zhì)、氨基酸等的游離氨基酸通過一系列復(fù)雜的非酶促反應(yīng)形成的結(jié)構(gòu)多樣的不可逆聚合物［1］。在不同組織中AGEs的聚集可以通過誘發(fā)氧化應(yīng)激等機制導(dǎo)致糖尿病的各種慢性并發(fā)癥［2］。腎臟是氧化應(yīng)激反應(yīng)比較敏感的組織，所以AGEs在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本試驗探討了糖化血紅蛋白(HbA1c)、血肌酐水平及糖尿病腎病分期對血清AGEs水平的影響，以期為進(jìn)一步研究AGEs在糖尿病腎病中的作用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2007年1至9月在我科住院明確診斷糖尿病腎病患者27例，男15例，女12例;平均年齡(64±7)歲;所有患者糖尿病病史＞5年，查眼底均合并視網(wǎng)膜病變，既往無高血壓及腎臟病史。按Mogensen的DN分期:Ⅲ期DN患者(尿微量白蛋白30～300 mg/24 h)8例，Ⅳ期DN患者 (尿蛋白定量＞0．5 g/24 h)11例，Ⅴ期未進(jìn)行血液透析DN患者血肌酐(Scr)＞133 μmol/L［(239±98)μmol/L］8例。

1．2 方法 血清AGEs的檢測采用競爭性 ELISA法，由于AGEs存在共同的抗原決定簇，因此，可以用單一AGEs修飾蛋白的抗體檢測總AGEs。在多種AGEs修飾蛋白中抗AGERNase抗體能夠非選擇性地識別所有 AGEs復(fù)合物，但與非AGEs修飾的蛋白及Amadori物質(zhì)不起反應(yīng)。

1．2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)方程的建立［3］:3 mg/L AGE-Ag 100μl包被96孔板(pH 9．6碳酸氫鹽緩沖液)，37℃ 2 h，4℃過夜，封閉1 h(封閉液0．01 mmol/L，PBS-1%BSA，150 μl)，洗3次;加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn) AGE-Ag(分 別 為 100、10、8、4、2、1、0．1 mg/L)和 AGE-Ab各50 μl(1∶1 000)，同時設(shè)總對照(不加標(biāo)準(zhǔn)AGE-Ag)和空白對照(不加AGE-Ab)，室溫孵育2 h，振蕩，洗3 次;加AKP-羊抗兔 IgG(1∶4 000，Sigma)100 μl，37℃孵育1 h，洗6次，稀釋液均為0．01mmol/L PBS和0．5%Tween 20和2%山羊血清混合液，清洗液均為0．01 mmol/L PBS和0．5%Tween 20的混合液，均設(shè)復(fù)孔。最后pNPP底物(Sigma)顯色，在405 nm波長下讀取A值，至總對照A值在1．2～1．5，計算標(biāo)準(zhǔn) AGE-Ag A比值 =(標(biāo)準(zhǔn) A 405-空白 A 405)/(總A405-空白A 405)。各標(biāo)準(zhǔn)濃度AGE-Ag A比值與其濃度之間關(guān)系模擬方程 y=1/(1+a×b)，擬合得方程 y=1/(1+0．1170 ×0．7081)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗 R=0．9915，R2=0．9830，P ＜0．01。表明通過此方程，標(biāo)準(zhǔn) A 405值能反映其AGEs水平。

1．2．2 血清AGEs檢測:－80℃冰箱保存的DN患者血清標(biāo)本經(jīng)1∶5稀釋后進(jìn)行AGEs檢測，均設(shè)復(fù)孔，取其平均A值代入上述方程計算出各標(biāo)本AGEs水平。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10．0統(tǒng)計軟件，糖尿病腎病患者AGEs水平采用方差分析，糖尿病腎病患者血清AGEs水平與年齡、性別、HbA1c水平及糖尿病腎病分期之間關(guān)系采用多元逐步回歸分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期組血清AGEs水平兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜ 0．05)。見表1。

2．2 2 型糖尿病腎病患者中血肌酐水平正常組與升高組血清AGEs水平分別為(32±7)μg/ml和(43±10)μg/m l，后者較前者顯著增高(P＜0．01)。

2．3 對27例2型糖尿病腎病患者進(jìn)行多元逐步回歸分析顯示在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期糖尿病腎病患者中血清AGEs水平與分期及HbA1c有關(guān)(標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)均為0．548、0．327，P ＜0．05)。

3 討論

AGEs是還原糖(如葡萄糖、果糖及葡萄糖-6-磷酸等酮糖)與蛋白質(zhì)、氨基酸等的游離氨基酸通過一系列復(fù)雜的非酶促反應(yīng)形成的結(jié)構(gòu)多樣的不可逆聚合物。目前有證據(jù)表明AGEs在糖尿病慢性并發(fā)癥包括大血管病變、微血管病變(糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病心肌病等)、神經(jīng)病變等的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。檢測體內(nèi)AGEs對臨床進(jìn)一步研究糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生、評估并發(fā)癥的程度、監(jiān)測長期血糖水平以及指導(dǎo)糖尿病治療等將具有十分重要的意義［4］。AGEs檢測方法包括熒光分析法、放射受體分析法、免疫學(xué)方法、高效液相層系(HPLC)等。ELISA法因其操作簡便、靈敏度和特異性也很高，有望在臨床大規(guī)模開展。

表1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期2型糖尿病腎病患者血清AGEs水平相關(guān)影響因素多元逐步回歸分析 μg/m l，±s

表1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期2型糖尿病腎病患者血清AGEs水平相關(guān)影響因素多元逐步回歸分析 μg/m l，±s

注:與Ⅲ期比較，*P ＜0．05;與Ⅳ期比較，#P ＜0．05

變量 AGEs P值年齡(歲)＜65(n=9) 33±6 ＞0．05≥65(n=18) 37±11性別男(n=15) 37±10 ＜0．05女(n=12) 34±9血肌酐水平正常組(n=19) 32±7 ＜0．01增高組(n=8) 43±10 HbA1c(%)＜8(n=10) 30±6 ＜0．01≥8(n=17) 39±10糖尿病腎病分期Ⅲ(n=8) 28±6Ⅳ(n=11) 36±6* ＜0．05Ⅴ(n=8) 43±10*#

糖尿病腎病是糖尿病的一種最常見的慢性微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。DN分為5期。Ⅲ期亦稱早期糖尿病腎病，多發(fā)生在病程＞5年的糖病腎患者。主要表現(xiàn)為尿蛋白排泄率持續(xù)于20～200μg/min(30～300 mg/24 h)，尿常規(guī)蛋白定量＜0．5 g/24 h，基底膜增厚和系膜基質(zhì)明顯增加;Ⅳ期即臨床糖尿病腎病，以大量白蛋白尿為特點，糖尿白排泄率＞200μg/min(＞300 mg/24 h)，或常規(guī)尿蛋白定量＞0．5 g/24 h，腎小球濾過率下降，并出現(xiàn)高血壓，基底膜進(jìn)一步增厚，系膜基質(zhì)進(jìn)一步增加，部分腎小球荒廢;Ⅴ期即終末期腎衰竭，腎小球濾過率嚴(yán)重減低，患者出現(xiàn)氮質(zhì)血癥，水腫及高血壓加重，腎小球廣泛硬化、荒廢［6］。Ⅰ期、Ⅱ期糖尿病腎病僅靠臨床癥狀及各項生化檢測指標(biāo)難以明確診斷分期，故本試驗選取Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期糖尿病腎病患者進(jìn)行研究分析。本研究結(jié)果表明在2型糖病腎病患者中，血肌酐水平升高者較血肌酐正常者血清AGEs水平增高。血清AGEs隨著分期的進(jìn)展而增高，Ⅲ期與Ⅳ期、Ⅴ期間存在著顯著差異。多元逐步回歸分析顯示2型糖尿病腎病患者血清AGEs水平與年齡無關(guān)，而與分期及HbA1c呈正相關(guān)，因Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期病程代表腎功能正常、腎小球濾過率下降、腎功能衰竭的腎功能進(jìn)展惡化過程，可以認(rèn)為在2型糖尿病患者中腎功能與長期血糖控制情況是影響血清AGEs的兩個因素，腎功能影響更為重要。如前所述，血清AGEs增高是由于產(chǎn)生增多和(或)降解清除減少所致。在2型糖病腎病腎功能損害患者這二方面因素皆存在。尤其Ⅳ期、Ⅴ期患者，腎小球濾過率明顯下降，更加重了AGEs的堆積。

AGEs主要的降解機制為機體多種細(xì)胞表面均存在著AGEs受體(AGER)，這些細(xì)胞尤其是單核巨噬細(xì)胞可以攝取AGEs，并將其降解和最終釋放出一種小分子可溶性 AGEs(LMW-AGE)。同樣細(xì)胞外基質(zhì)中AGEs受蛋白酶降解，裂解成AGEs片段。這些AGEs降解產(chǎn)物釋放入血，由腎臟清除。AGEs在血液透析患者的心血管組織中蓄積，在腎移植患者中減少。提示AGEs蓄積不僅與高血糖(糖尿病)密切相關(guān)更與腎功能異常關(guān)系密切。AGEs在糖尿病腎病中的致病作用已得到證實。AGEs的以下作用與DN有關(guān):(1)與腎小球系膜細(xì)胞上的特異性AGEs受體結(jié)合增加細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生［7］;(2)與膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)使蛋白質(zhì)在組織中的沉積增加，降低基質(zhì)降解酶活性使ECM成分降解減慢;(3)滅活一氧化氮(NO)，影響腎臟血流動力學(xué)，修飾脂蛋白與糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān);(4)損傷DNA和核酸蛋白影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)等。因此AGEs造成糖尿病腎病患者系膜基質(zhì)堆積、腎小球和腎小管基底膜增厚，選擇性通透能力喪失和蛋白尿發(fā)生［8］。最終導(dǎo)致腎小球硬化。

1 劉志紅，黎磊石．探索糖尿病腎病防治的新途徑．腎臟病與透析腎移植雜志，2002，11:1-2．

2 Harrington CR，Colaco CA．Alzheimer’s disease．A glycation connection．Nature，1994，370:747．

3 Vlassara H，Palace MR．Diabetes and advanced glycation endproducts．J Int Med，2002，251:87-101．

4 Schiel R，F(xiàn)ranke S，Busch M，etal．Effectof smoking on risk factors for cardiovascular disease in patientswith diabetesmellitusand renal insufficiency．Eur JMed Res，2003，8，283-291．

5 Bierhaus A，Schiekofer S，Schwaninger M，et al．Diabetes-associated sustained activation of the tranScription factor nuclear factor-kappa B．Diabetes，2001，50:2792-2808．

6 Mason RM，Wahab NA．Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy．JAm Soc Nephrol，2003，14:1358-1373．

7 Shibata K，Dohi K，F(xiàn)njii Y，et al．Intraglomerular eoagulation and fibrindysis in human Primiary glomerular diseses．Nippon Jinzo Gakkai Shi，1991，33:719-729．

8 Shoji T，Koyama H，Morioka’T，et al．Recepter for advanced glycation end products is involved in impaired agniogenic response in diabetes．Diabetes，2006，55:2245-2255．