劉改英，潘道東,2,*，郭宇星

(1.南京師范大學(xué) 國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合蛋白酶水解雞肉蛋白工藝研究

劉改英1，潘道東1,2,*，郭宇星1

(1.南京師范大學(xué) 國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

為得到更好的肉味香精前體物，采用復(fù)合蛋白酶對(duì)雞肉蛋白進(jìn)行水解研究，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化。選用溫度、pH值、液固比和水解時(shí)間4個(gè)反應(yīng)因素，以蛋白質(zhì)的水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素工藝試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化雞肉蛋白質(zhì)的水解條件。結(jié)果表明，最優(yōu)水解條件為溫度51.13℃、水解pH6.99、液固比2.85:1(mL/g)、水解時(shí)間5.22h，在此水解條件下，水解度可達(dá)到35.22%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)水解度為(35.09±0.51)%，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與軟件優(yōu)化結(jié)果相符。

雞肉蛋白質(zhì)；酶解；響應(yīng)面；優(yōu)化

早期的肉味香精，對(duì)于改善肉類食品的風(fēng)味，掩蓋肉類食品的異味是有效的，但并不是嚴(yán)格意義上的肉味香精，它們主要是由天然香料調(diào)配而成的。目前肉味香精發(fā)展于近30年，其主流是酶解技術(shù)用于水解氮源物質(zhì)，用水解動(dòng)物蛋白(HAP)、水解植物蛋白(HVP)作為肉味香料的前體物，再配合以氨基酸、酵母膏、還原糖和脂肪等物質(zhì)，經(jīng)美拉德反應(yīng)形成香氣濃郁圓潤、口感醇厚逼真的肉味香精[1]。

我國是雞肉生產(chǎn)大國，雞肉產(chǎn)量連續(xù)10余年居世界前列，有豐富的雞肉資源，可為肉類深加工行業(yè)提供充足的原料。然而我國肉雞深加工產(chǎn)品種類較少，且科技含量低、附加值不高，在國際市場上缺乏競爭力、行業(yè)抗風(fēng)險(xiǎn)能力較差，因此發(fā)展雞肉深加工勢在必行[2-3]。肉雞分割產(chǎn)品的主產(chǎn)品——雞胸肉，具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，是優(yōu)質(zhì)的蛋白來源，但受各種因素的影響，在國內(nèi)市場上價(jià)格相對(duì)較低。而采用酶水解法生產(chǎn)的水解動(dòng)物蛋白，既含有豐富的活性肽和游離氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，又保持了肉的原鮮味，同時(shí)不含氯丙醇等有毒物質(zhì)，在食品等行業(yè)中有較好的應(yīng)用前景[4]。因此，水解雞肉蛋白作為肉味香精的前體物具有雙重意義。

但是，酶法水解的動(dòng)物蛋白有一定的苦味。苦味肽的端基多為疏水性氨基酸，如果用外切酶切除此類疏水性氨基酸，游離出的疏水氨基酸與原苦味肽相比苦味要低得多[5]，風(fēng)味蛋白酶既是內(nèi)切酶也是外切酶，因此風(fēng)味蛋白酶在一定程度上能有效脫苦，所以本實(shí)驗(yàn)采用風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶及中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)合，希望在改善水解效果的基礎(chǔ)上得到更優(yōu)質(zhì)的蛋白液，使其成為適合熱反應(yīng)制備雞肉香精的優(yōu)質(zhì)前體物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞脯肉(冷藏) 市購。中性蛋白酶(5×104U/g)、木瓜蛋白酶(8×105U/g) 南京奧多福尼生物科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶(4×104U/g) 上海博蘊(yùn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；PHS-3L型精密PH計(jì) 上海今邁儀器儀表有限公司；LDS5-1離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；722型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程[6]

雞胸肉→預(yù)處理→搗碎→加去離子水→調(diào)節(jié)pH值→加酶恒溫水解→100℃滅酶15min→4000r/min離心20min→過濾→雞肉水解蛋白液

1.3.2 總氮量測定

采用凱氏定氮法[7]測定。

1.3.3 氨基氮測定

采用茚三酮比色法[8]測定。

1.3.4 蛋白質(zhì)水解度的測定

水解度指水解斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比。水解斷裂的肽鍵數(shù)可通過水解放出的氨基氮數(shù)目來測定[9]。

DH/%=(水解液中游離氨基氮量－原料中原有氨基氮量)/樣品中總氮量×100

1.3.5 感官評(píng)定方法[10]

以雞脂香、雞肉香味、肉香味、焦香味、硫臭味、鮮味、苦味等方面為指標(biāo)按較弱(－3)、稍弱(－2)、弱(－1)、一般(0)、稍好(1)、好(2)、較好(3)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并就可以接受性進(jìn)行評(píng)分。

1.3.6 氨基酸含量的測定

OPA(鄰苯二甲醛)氨基酸分析法。

1.3.7 酶解條件單因素設(shè)定

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用相同的加酶量，以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同的酶解溫度、p H值、液固比和反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白酶水解效果的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，運(yùn)用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[11]，選擇對(duì)水解度顯著影響的因素：時(shí)間、溫度、pH值、液固比，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels in the central composite design

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用F檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義。數(shù)據(jù)分析軟件采用Design-Expert 7.1.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類對(duì)水解度及雞肉風(fēng)味的影響

實(shí)驗(yàn)測得雞肉蛋白含量為20.8%。以雞肉為底物，分別用木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶，以及木瓜蛋白酶復(fù)配風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶復(fù)配風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶復(fù)配風(fēng)味蛋白酶及中性蛋白酶(復(fù)配比例均為1:1)進(jìn)行水解，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，液固比(去離子水體積/mL與雞肉質(zhì)量/g之比)為2:1、酶用量1000U/g蛋白、溫度50℃、pH7。水解結(jié)束后，100℃沸水滅酶15min，4000r/min離心20min，過濾，取濾液分別進(jìn)行水解度測定。

圖1 不同蛋白酶對(duì)雞肉水解效果的影響Fig.1 Effect of protease on hydrolysis efficiency of chicken protein

從圖1可以看到，水解效果比較好的是木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合及木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的復(fù)合，但是3種酶復(fù)合的水解效果30.21%與兩種酶復(fù)合的29.37%相比并沒有明顯的優(yōu)勢，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶作為試驗(yàn)用酶較為合理。

選用木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶作為實(shí)驗(yàn)用酶，在同上實(shí)驗(yàn)的水解條件下，分別水解0、1、2、3、4、5、6、7 h，得到不同水解度的雞肉湯，然后對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)分，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，水解度在29%左右的時(shí)候，雞肉湯風(fēng)味最佳，當(dāng)水解度繼續(xù)增加時(shí)，雞肉湯風(fēng)味反而會(huì)隨著水解度的增加而苦味增加，因此水解度被控制在29%左右時(shí)最為適宜。

圖2 不同水解度對(duì)雞肉風(fēng)味的影響Fig.2 Effect of hydrolysis degree on chicken flavor

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 液固比對(duì)水解度的影響

圖3 液固比對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of liquid solid ratio on hydrolysis degree of chicken protein

液固比對(duì)水解反應(yīng)效果有影響，主要是因?yàn)橐汗瘫鹊淖兓瘯?huì)引起酶反應(yīng)體系中底物濃度和酶濃度的變化。由圖3可知，隨著液固比的增加，水解度先增大后減小，液固比3:1(mL/g)左右時(shí)水解度最大，為28.46%。因此，反應(yīng)液固比為3:1(mL/g)左右為最適。

2.2.2 初始pH值的變化對(duì)水解度的影響

圖4 初始pH值對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of initial pH on hydrolysis degree of chicken protein

pH值影響酶的穩(wěn)定性，所以pH值對(duì)水解反應(yīng)影響很大。各種酶都有各自的最適pH值范圍，由圖4可知，pH7左右時(shí)，水解度最大，為32.30%，所以木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合的最適pH值取7。

2.2.3 溫度對(duì)水解度的影響

圖5 溫度對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken protein

由圖5可知，在一定的溫度范圍內(nèi)隨著反應(yīng)溫度的升高，水解度不斷增加但超過一定溫度后，水解度會(huì)隨著溫度的升高而降低。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)升高溫度，反應(yīng)速度加快，酶解效率也相應(yīng)提高，但溫度過高，酶蛋白變性[12]，酶的穩(wěn)定性下降，酶解效率隨之降低。所以，最適溫度為5 0℃。

2.2.4 時(shí)間對(duì)水解度的影響

圖6 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of reaction time on hydrolysis degree of chicken protein

由圖6可知，隨著時(shí)間的增加，水解度不斷增加，當(dāng)增加到一定程度，時(shí)間為5h的時(shí)候，增加的速度開始變慢，綜合考慮效率及成本的問題，單因素水解時(shí)間最優(yōu)選5h。

2.3 復(fù)合蛋白酶水解雞肉蛋白質(zhì)的響應(yīng)面試驗(yàn)分析

復(fù)合蛋白酶水解雞肉蛋白的響應(yīng)面分析試驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了29組試驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。利用Design Expert 7.1.3軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到復(fù)合蛋白酶水解雞肉蛋白的回歸方程如下：

表2 Box-Bchnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Behnken experimental design matrix and experimental results

從該模型的方差分析表3可見，所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)。失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著(P=0.4319＞0.05)，其決定系數(shù)為0.9792，校正決定系數(shù)為0.9585，說明該模型能解釋95.85%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的4.15%不能用此模型來解釋，說明該模型擬合程度良好，用該模型對(duì)復(fù)合蛋白酶水解雞肉蛋白的水解過程進(jìn)行優(yōu)化是合適的。

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析表Table3 Variance analysis for the developed quadratic polynomial model

對(duì)上述方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明(表4)，試驗(yàn)中X1、X2、X1X2、X2X3和X3X4這幾個(gè)因素對(duì)水解度的影響顯著，表明在復(fù)合蛋白酶水解雞肉蛋白的過程中，水解時(shí)間對(duì)水解度有顯著影響；X1X2、X2X3、X3X4的交互作用影響也顯著，即水解過程中，時(shí)間和溫度、溫度和pH值、pH值和液固比之間的交互作用也對(duì)水解度造成顯著影響。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table4 Significance test of regression coefficients for the developed quadratic polynomial model

圖7 溫度和時(shí)間交互影響水解度的曲面圖及等高線圖Fig.7 Response surface plot and its contour plot showing the effect of cross-interaction between hydrolysis temperature and hydrolysis time on hydrolysis degree of chicken protein

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子溫度、pH值、時(shí)間、液固比所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，結(jié)果如圖7～12所示。從圖7～12可看出，溫度與pH值對(duì)水解度的交互作用影響最大，pH值與液固比次之，時(shí)間與溫度再次之。

圖8 時(shí)間和pH值交互影響水解度的曲面圖及等高線圖Fig.8 Response surface plot and its contour plot showing the effect of cross-interaction between hydrolysis time and pH on hydrolysis degree of chicken protein

圖10 溫度和pH值交互影響水解度的曲面圖及其等高線圖Fig.10 Response surface plot and its contour plot showing the effect of cross-interaction between hydrolysis temperature and pH on hydrolysis degree of chicken protein

圖9 時(shí)間和液固比交互影響水解度的曲面圖及其等高線圖Fig.9 Response surface plot and its contour plot showing the effect of cross-interaction between hydrolysis time and liquid-solid ratio on hydrolysis degree of chicken protein

圖11 溫度和液固比交互影響水解度的曲面圖及其等高線圖Fig.11 Response surface plot and its contour plot showing the effect of cross-interaction between hydrolysis temperature and liquid-solid ratio on hydrolysis degree of chicken protein

圖12 pH值和液固比交互影響水解度的曲面圖及其等高線圖Fig.12 Response surface plot and its contour plot showing the effect of cross-interaction between pH and liquid-solid ratio on hydrolysis degree of chicken protein

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 7.1.3軟件獲得了各個(gè)因素的最佳水解條件組合為溫度51.13℃、水解pH6.99、液固比2.85:1(mL/g)、水解時(shí)間5.22h，在此水解條件下，水解度可達(dá)到35.22%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳水解條件下進(jìn)行水解，做3組平行實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果為(35.09±0.51)%，由此可得，采用響應(yīng)面分析法對(duì)雞肉蛋白最佳酶解條件的優(yōu)化是行之有效的。

利用優(yōu)化條件做不同時(shí)間的水解實(shí)驗(yàn)，以期得到效率最優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果如圖1 3。

圖13 時(shí)間對(duì)最優(yōu)條件的影響Fig.13 Effect of hydrolysis time on optimal conditions of enzymatic hydrolysis

通過實(shí)驗(yàn)實(shí)證，水解度在3.5 h時(shí)就可以達(dá)到29.64%。

2.5 氨基酸的測定結(jié)果

表5 游離氨基酸含量對(duì)應(yīng)表Table5 Change in free amino acid composition before and after optimized hydrolysisμmol/mL

游離氨基酸決定著水解液的風(fēng)味特征，同時(shí)游離氨基酸在制備肉味香精時(shí)比肽更易發(fā)生反應(yīng)[13]。從表5可以看出，水解后的游離氨基酸比水解前的游離氨基酸有了明顯改善，并且對(duì)水解液風(fēng)味起著重要作用的鮮味氨基酸[14]，即谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸，總數(shù)占總量的比例明顯增多。含硫氨基酸——蛋氨酸和半胱氨酸雖然占總量比例較小，但相比水解之前也有著明顯增多?？傮w來說，利用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合水解雞肉蛋白，更有益于雞肉蛋白液作為肉味香精前體物。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以水解度為響應(yīng)指標(biāo)，通過四因素三水平的響應(yīng)分析對(duì)木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶水解雞肉蛋白質(zhì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)方差分析得知時(shí)間與溫度對(duì)水解度的交互影響顯著，溫度與pH值及pH值與液固比對(duì)水解度的交互影響極顯著。最佳水解條件為溫度51.13℃、水解pH6.99、液固比2.85:1(mL/g)、水解時(shí)間5.22h，在此水解條件下，水解度為35.22%。為制備無苦味的肉味香精前體物，本實(shí)驗(yàn)將水解度控制在29%附近，通過響應(yīng)面優(yōu)化找到了一個(gè)效率最優(yōu)點(diǎn)，并且此條件下得到的酶解液雞香濃郁，無苦味。水解液經(jīng)真空濃縮、噴霧干燥可制得雞肉水解蛋白粉，用于雞肉香精的反應(yīng)前體物。在實(shí)際試驗(yàn)過程中，可以通過控制時(shí)間來控制水解度，用不同水解度的雞肉蛋白粉前體物來進(jìn)行雞肉香精的研究，以便得到更好風(fēng)味的肉味香精。

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Optimization of Compound Protease Hydrolysis for Chicken Protein through Response Surface Methodology

LIU Gai-ying1，PAN Dao-dong1,2,*，GUO Yu-xing1
(1. Branch Center of National Dairy Products Processing Technology Development, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In order to obtain better precursor of meat flavors, chicken protein was hydrolyzed by compound proteases to produce active peptides. The effect of hydrolysis temperature, pH, liquid-solid ratio and hydrolysis time on hydrolysis degree was explored to optimize the hydrolysis conditions of chicken protein through Box-Benhnken response surface analysis on the basis of single-factor experiments.The optimal hydrolysis temperature, pH, liquid/solid ratio and hydrolysis time were found to be 51.13 ℃, 6.99, 2.85:1 and 5.22 h, respectively. Under these optimal hydrolysis conditions, the predicted hydrolysis degree was 35.22%, which was consistent with the average of three replicates of (35.09 ± 0.51)% obtained in the validation experiments.

chicken protein；enzymatic hydrolysis；response surface methodology；optimization

TS201.1

A

1002-6630(2010)20-0208-07

2010-01-13

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2009366)

劉改英(1984—)，女，碩士研究生，主要從事肉品加工技術(shù)研究。E-mail：liugaiying2006@eyou.com

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，主要從事畜產(chǎn)品加工研究。E-mail：daodongpan@163.com