勵(lì)建榮，尹 潔，朱軍莉，章 慶

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化香菇中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的超聲輔助提取條件

勵(lì)建榮，尹 潔，朱軍莉，章 慶

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035)

采用響應(yīng)面分析法對香菇中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明超聲輔助提取GGT的最佳條件為提取功率、提取時(shí)間、料液比的最佳條件分別為204.84W、28.19min、1:52.29。在上述提取條件下，提取液中GGT的提取率達(dá)到11.19U/g，與模型預(yù)測值基本相符。

香菇；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；超聲輔助提取；響應(yīng)面法

很多生物體都會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性甲醛，其中以香菇最為突出，2001年“香菇甲醛”事件使我國食用菌產(chǎn)業(yè)蒙受巨大損失。香菇中內(nèi)源性甲醛的研究始于上世紀(jì)70年代，日本學(xué)者Yasumto[1-4]及Fujimoto等[5]首次對香菇甲醛的形成機(jī)理作了研究報(bào)道，他們將粗酶提取液作用于滅酶的香菇勻漿液，發(fā)現(xiàn)香菇甲醛是其特征風(fēng)味物質(zhì)酶學(xué)代謝途徑的副產(chǎn)物，其中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γglutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)是該催化反應(yīng)產(chǎn)生甲醛的關(guān)鍵酶[6]。目前對細(xì)菌、酵母中GGT的研究較多，對香菇中GGT的研究較少，對其提取效率的研究更少。對該酶的結(jié)構(gòu)及其酶學(xué)性質(zhì)研究有助于進(jìn)一步明晰甲醛在香菇風(fēng)味物質(zhì)形成途徑產(chǎn)生的機(jī)理，并且為開發(fā)香菇甲醛產(chǎn)生的抑制方法提供科學(xué)的參考依據(jù)。而香菇中蛋白質(zhì)含量較低，要獲得足夠量且活力未嚴(yán)重?fù)p失的GGT粗酶液以供進(jìn)一步研究，提取效率的提高十分關(guān)鍵。已知GGT是廣泛存在于生物體內(nèi)參與谷胱甘肽循環(huán)的酶，該酶主要存在于細(xì)胞膜的外表面上，通過亞基和細(xì)胞膜相連[7]，使常規(guī)靜置提取法提取率較低。超聲波技術(shù)用于蛋白質(zhì)及酶的提取具有明顯的優(yōu)勢，與靜置提取法相比，超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)、攪拌作用等可以加速提取成分的釋放，提高提取率，有效縮短提取時(shí)間[8-10]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法改進(jìn)香菇中GGT的提取工藝，為深入研究GGT及香菇內(nèi)源性甲醛的形成機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菇采自浙江慶元，經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎，保存于－70℃；γ-谷氨酰-對硝基苯胺(γ-glutamyl-P-nitroanilide)、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)、對硝基苯胺(P-nitroanilide) 美國Sigma公司；其余試劑為國產(chǎn)AR級試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2550紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海新芝生物技術(shù)研究所；DELTA320 pH計(jì) 美國Mettler Toledo公司。

1.3 香菇GGT的提取方法

準(zhǔn)確稱取1.00g香菇粉置于100mL三角燒瓶中，加入一定量0.5mol/L Tris-HCl(pH 7.6)緩沖液，放置在冰浴環(huán)境中，用超聲輔助提取法提取GGT，將該提取液8000 ×g離心20min后取上清液測酶活，計(jì)算得率。

1.4 酶活測定方法及提取率計(jì)算

GGT催化γ-glutamyl-P-nitroanilide的產(chǎn)物P-nitroanilide在410nm處有吸光度[11]，酶活性由生成產(chǎn)物的量反映。反應(yīng)體系為0.5mol/L Tris-HCl(pH7.6)緩沖液4.0mL、酶液 0.5mL、3.5μmol/mL底物0.5mL，37℃反應(yīng)20min，加入3mL 1.5mol/L乙酸終止反應(yīng)，過濾后在410nm處測吸光度(A)。酶活單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1μmol的P-nitroanilide為1個(gè)酶活單位。

GGT提取率/(U/g)=樣品GGT活性/香菇粉質(zhì)量

1.5 單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)

超聲輔助提取法單因素試驗(yàn)分析不同料液比、提取時(shí)間、功率對GGT得率的影響。具體為稱取1.00g香菇粉，分別加入0.5mol/L Tris-HCl(pH7.6)緩沖液25、50、75、100、150mL，在4℃提取功率200W條件下提取10min；相同處理?xiàng)l件下，在4℃提取功率200W條件下分別提取5、10、20、30、40min；相同處理?xiàng)l件下，提取功率分別在50、100、150、200、250W條件下提取10min。根據(jù)單因素試驗(yàn)，結(jié)合Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化GGT的超聲輔助提取法料液比、提取時(shí)間和功率提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取GGT的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對GGT提取率的影響

設(shè)計(jì)料液比分別為1:25、1:50、1:75、1:100和1:150，在提取功率200W條件下超聲提取10min，以考察料液比對GGT含量的影響(圖1)。由圖1可知，隨著料液比的提高，GGT提取率不斷增加，當(dāng)料液比達(dá)到1:50后，進(jìn)一步增加溶液的量，溶液中GGT含量增加不明顯。高料液比條件下，GGT總的溶出量增加，提取過程中液相濃度增加快，兩相濃度差減少加快[12]。高料液比在一定程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但從提取效果、原料用量等方面綜合考慮，確定料液比1:50較適宜。

圖1 料液比對GGT提取率的影響Fig.1 Effect of material/water ratio on GGT extraction

2.1.2 提取功率對GGT提取率的影響

圖2 提取功率對GGT提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on GGT extraction

固定料液比1:50，提取功率分別為50、100、150、200、250W超聲提取10min，考察提取功率對GGT提取率的影響(圖2)。由圖2可知，提取功率對GGT提取率具有顯著的影響。功率越高，GGT提取率越高，兩者呈線性正相關(guān)關(guān)系。提取功率越高，對香菇細(xì)胞的破壞作用越大，溶劑擴(kuò)散也越快，越有利于GGT的浸出。當(dāng)功率大于200W時(shí)，進(jìn)一步增加提取功率，GGT提取率下降。這可能是因?yàn)檫^高的功率產(chǎn)生的瞬間高溫會(huì)使GGT的活性降低，因此，選擇200W為較佳的提取功率。

2.1.3 提取時(shí)間對GGT提取率的影響

固定料液比為1:50，在提取功率為200W條件下分別超聲提取5、10、20、30、40min，以考察提取時(shí)間對GGT提取率的影響(圖3)。由圖3可知，提取時(shí)間對GGT提取率有著顯著的影響，在30min時(shí)GGT提取率最大，而后隨著提取時(shí)間的進(jìn)一步延長，GGT提取率出現(xiàn)了明顯的下降趨勢。超聲促進(jìn)胞內(nèi)的GGT釋放并擴(kuò)散到胞外的溶劑中，大部分存在于破碎細(xì)胞內(nèi)的GGT在最初的30min內(nèi)釋放到提取溶劑中，因而GGT提取率在這段時(shí)間內(nèi)發(fā)生了顯著的增長。但是過長時(shí)間的超聲作用可能導(dǎo)致部分GGT結(jié)構(gòu)破壞，GGT活性也隨之下降，據(jù)此初步確定30min為較適宜的提取時(shí)間[13]。

圖3 提取時(shí)間對GGT提取率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on GGT extraction

2.2 采用響應(yīng)面法優(yōu)化GGT的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14-16]，利用Minitab15軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表Table1 Factors and levels in the response surface design

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table2 Response surface design matrix and experimental results

表3 回歸方程的方差分析Table3 Variance analysis of the developed regression model

用Design-expert 7.0 對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析及方差分析，擬合得到回歸方程為Y=10.43＋0.47A＋2.13B－0.025C+0.31AB－0.53AC－1.23BC－1.88A2－6.11B2－0.80C2

從表3可以看出，回歸方程因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.9187)，方程P= 0.0285＜0.05，說明此回歸方程顯著；失擬項(xiàng)P=0.0970＞0.05，說明方程對實(shí)驗(yàn)的擬合度較好，此實(shí)驗(yàn)方法可靠。

2.2.2 提取工藝的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

顯著因素水平的優(yōu)化運(yùn)用Design-expert 7.0 軟件對回歸模型進(jìn)行規(guī)范性分析，尋求最大提取率的穩(wěn)定點(diǎn)及對應(yīng)的因素水平，結(jié)合圖4～6給出的回歸方程的三維響應(yīng)面圖和等高線圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)即最大值。對回歸方程求極值點(diǎn)得：A=0.0968，B=－0.1811，C=0.0914，Y=9.897，即提取功率、提取時(shí)間、料液比的最佳值分別為204.84W、28.19min、1:52.29，此時(shí)GGT提取率達(dá)到最大值為11.19U/g。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，GGT平均提取率為11.07U/g，與理論值基本相符，這說明回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對GGT提取率的影響。

圖4 提取功率與提取時(shí)間對GGT提取率交互影響效應(yīng)響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of ultrasonic power and extraction duration on GGT extraction

圖5 提取功率與料液比對GGT提取率交互影響效應(yīng)響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of ultrasonic power and material/water ratio on GGT extraction

圖6 提取時(shí)間與料液比對GGT提取率交互影響效應(yīng)響應(yīng)面立體分析圖及其等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of extraction duration and material/water ratio on GGT extraction

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選取料液比、提取時(shí)間、提取功率3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和Minitab15、Designexpert 7.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析，得到超聲輔助提取GGT的最佳條件為：提取功率、提取時(shí)間、料液比的最佳條件分別為204.84W、28.19min、1:52.29。在最佳提取條件下，提取液中GGT的提取率達(dá)到11.19U/g，與理論值基本相符。這說明回歸方程較真實(shí)地反映各因素對GGT提取率的影響。

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Optimization of Conditions for Ultrasonic-assisted Extraction of γ-Glutamyltranspeptidase from Shiitake Mushroom by Response Surface Methodology

LI Jian-rong，YIN Jie，ZHU Jun-li，ZHANG Qing
(Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

In order to optimize the ultrasonic-assisted extraction of γ-glutamyltranspeptidase (GGT) from shiitake mushroom, single factor investigations were initially carried out, followed by construction of a three-factor, three-level Box-Benhnken experimental design, quadratic regression fitting for GGT activity as a function of three extraction conditions and response surface analysis. The optimal conditions for the ultrasonic-assisted extraction of GGT were found to be: ultrasonic power, 204.84 W; extraction duration, 28.19 min; and material/water ratio, 1:52.29. Under the above conditions, the experimental value of GGT activity was 11.19 U/g, which was in basic agreement with the model predicted value.

shiitake mushroom；γ-glutamyltranspeptidase；ultrasonic-assisted extraction；response surface methodology

Q949.329.81；O658

A

1002-6630(2010)20-0020-04

2009-10-18

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(208054)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(R3090330)；國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009IK180)

勵(lì)建榮(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品貯藏加工與安全控制及食品生物技術(shù)。E-mail：lijianrong@zjgsu.edu.cn