劉淑娟，譚正初，鐘興剛,2

（1.湖南省農(nóng)科院茶葉研究所,湖南長沙410125）（2.湖南省茶葉檢測中心,湖南長沙410125）

0 引言

由于人們在防治病蟲害過程中不合理和超劑量使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致了糧食、蔬菜、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留問題，不僅影響了農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，也危害人類的健康。傳統(tǒng)上有機(jī)磷農(nóng)藥分析方法主要是利用氣相色譜、薄層色譜、高效液相色譜以及各種光譜聯(lián)用技術(shù)[1]。雖然這些方法的選擇性、靈敏度和準(zhǔn)確度高，但需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品的前處理過程繁瑣、費(fèi)時，并且對分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于現(xiàn)場檢測。而且儀器分析法多為檢測干物質(zhì)中的農(nóng)殘含量，不能準(zhǔn)確反映人體實際攝入的農(nóng)殘含量。

與傳統(tǒng)分析技術(shù)相比，有機(jī)磷傳感器快速檢測法具有簡單、快速、靈敏、低成本和便于攜帶等優(yōu)點[2～5]。國內(nèi)外關(guān)于利用膽堿酯酶和有機(jī)磷水解酶檢測有機(jī)磷的文獻(xiàn)已有報道，如Albareda等[6]用乙酰膽堿酯酶直接檢測自來水和果汁樣品中的對氧磷和敵百威。Josiane等[7]用乙酰膽堿酯酶傳感器測定西紅柿中的西維因，并與高效液相色譜法比較，取得較好的分析結(jié)果。Suprun等[8]用傳感器對涕滅威、對氧磷和甲基對硫磷等3種農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，檢出限分別為30、10和5 μg/mL。但酶傳感技術(shù)因其成本高，酶分子易失活、不易再生等缺點，應(yīng)用起來有一定的局限性。

研究表明，納米粒子具有特殊的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，以及由此產(chǎn)生的許多光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)[9]。一些納米材料，例如納米Au[10]、納米Ag[11]、納米TiO2[12]、納米ZrO2[13]、納米Al2O3[14]等具有良好的生物相容性，將其運(yùn)用到生物傳感器中，可提供生物材料適宜的微環(huán)境，達(dá)到維持生物組分活性、改進(jìn)生物傳感器性能的目的。研究納米粒子在生物分子固定中的應(yīng)用對于開發(fā)高性能、具有特殊功能的復(fù)合材料具有十分重要的意義。ZrO2是一種無毒性的無機(jī)氧化物材料，具有熱穩(wěn)定性、化學(xué)惰性和良好的生物兼容性[15～16]。制備ZrO2粒子的方法已有報道，ZrO2粒子作為一種多功能的無機(jī)材料已得到較為廣泛的應(yīng)用[17～21]。

該文將ZrO2納米粒子用于有機(jī)磷傳感器的構(gòu)造，大大提高了傳感器的響應(yīng)性能。先在金面上電沉積一層ZrO2納米粒子，然后將此電極浸入一定濃度的有機(jī)磷溶液中進(jìn)行吸附，根據(jù)對應(yīng)電極的方波溶出伏安法峰電流的大小來實現(xiàn)溶液中有機(jī)磷的定量檢測（圖1）。實驗結(jié)果表明，以ZrO2納米粒子吸附有機(jī)磷制成的甲基對硫磷傳感器構(gòu)造簡單，克服了酶傳感器不穩(wěn)定、酶分子易失活等缺點，降低了傳感器的構(gòu)建成本，傳感界面對甲基對硫磷的檢出限低，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，而且電極檢測速度快，操作簡便，使用壽命較長，可直接用于茶湯中有機(jī)磷農(nóng)殘的快速檢測。此外，傳感器可以再生反復(fù)使用，再生過程簡單。

圖1 有機(jī)磷傳感器構(gòu)建原理圖Fig.1 Scheme of Ops electrochemical sensor

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI760b電化學(xué)工作站購于中國上海辰華儀器廠，金電極（直徑為3 mm）購于上海辰華儀器廠，電化學(xué)反應(yīng)池為三電極系統(tǒng)，其中修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極。ZrOCl2·8H2O購于廣東省汕頭市光華試劑廠；其它試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水。

1.2 傳感器的制備

參照文獻(xiàn)[22]的方法，金電極在使用前分別用0.3 μm和0.05 μm的鋁粉拋光至鏡面，并依次在6 mol/L HNO3、丙酮和二次蒸餾水中各超聲洗滌2 min，水洗并用氮氣吹干。實驗開始前，把清洗過的電極置于0.2 mol/L硫酸中，在0.5～1.5 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，水洗吹干備用。然后將處理好的金電極放入含5.0 mmol/L ZrOCl2的0.1 mol/L KCl溶液中，在-1.1～0.7 V之間以20 mV/s的速率掃描十個循環(huán)。取出水洗并用氮氣吹干。

1.3 樣品前處理

取茶葉樣品3 g用150 mL 0.1 mol/L KCl（90℃,pH7.0）溶液浸泡10 min后過濾冷卻即可用于測量。

1.4 檢測方法

將ZrO2/Au電極浸入含一定濃度有機(jī)磷農(nóng)藥的0.1 mol/L KCl溶液中輕微攪拌2 min，用去離子水洗滌，置于含10 mL 0.1 mol/L KCl溶液的小燒杯中。在開始測量前，該KCl溶液通氮氣5 min以除去溶液中的氧。在電壓-0.4～0.3 V之間進(jìn)行方波伏安（SWV）測量，電位增量為4 mV，頻率為25 Hz。用CHI660軟件作基線校正。所有試驗均在室溫下進(jìn)行。

1.5 傳感器的再生

將傳感器進(jìn)行多次SWV掃描可使吸附的有機(jī)磷洗脫，然后電極用去離子水和緩沖液清洗，就可進(jìn)行下一次的測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 電沉積循環(huán)伏安圖

在文中，將金電極置于5.0 mmol/L ZrOCl2和0.5 mol/L KCl混合溶液中，通過電化學(xué)掃描實現(xiàn)ZrO2納米粒子在金電極上的沉積。圖2顯示了在金電極上ZrO2納米顆粒電沉積的循環(huán)伏安圖。實驗中所用的電壓范圍是-1.1～0.7 V，掃描速率是20 mV/s，一共掃描十個循環(huán)。陰極和陽極電流在-0.6到-1.1 V電壓范圍內(nèi)的顯著變化反映金面上發(fā)生了復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)[17]。從圖中可看出，從第一輪到第十輪循環(huán)，還原峰逐漸變?nèi)酰咫娏髦饾u減小。推測陰極電流的減小是因為金面上ZrO2薄層膜的形成阻礙了氧化還原反應(yīng)的進(jìn)程引起的。金電極表面ZrO2納米顆粒為有機(jī)磷的固定提供了一個較大的有效表面積，有利于有機(jī)磷在其表面的吸附，提高傳感器的響應(yīng)性能。

圖2 金電極在0.5 mol/L KCl溶液中(a)及金電極在5.0 mmol/L ZrOCl2和0.5 mol/L KCl混合溶液中(b)的循環(huán)伏安圖Fig.2 The cyclic voltammograms of the cleaned gold electrode in 0.5 mol/L KCl(a)and in 5.0 mmol/L ZrOCl2 and 0.5 mol/L KCl(b),scan rate 20 mV/s

2.2 傳感器工作原理

該文采用金電極表面電沉積二氧化鋯納米粒子制成了OPs/ZrO2粒子層/金電極電流型生物傳感器。在吸附氨基甲酸酯和有機(jī)磷物質(zhì)后，該傳感器在0.1 mol/L KCl溶液中做SWV掃描，在掃描電位0.093 V會有一個SWV溶出峰，根據(jù)溶出峰電流的大小可實現(xiàn)溶液中有機(jī)磷的定量檢測。將組裝好的電極浸入一定濃度有機(jī)磷溶液進(jìn)行吸附后，將OPs/ZrO2/Au電極在10 mL 0.1 mol/L KCl進(jìn)行溶出伏安掃描，參考文獻(xiàn)[22]用Sigmaplot軟件對其進(jìn)行基線校正處理，得出相應(yīng)的溶出伏安圖（圖3），根據(jù)溶出峰電流的大小可計算有機(jī)磷的濃度。ZrO2納米粒子對磷酸基團(tuán)有很強(qiáng)的吸附能力，在電極上電沉積的ZrO2納米粒子層有效地擴(kuò)大了電極的表面積，大大增加了電極表面有機(jī)磷的吸附量（圖4）。

圖3 傳感器在0.1 mol/L KCl溶液中的溶出伏安圖，插圖為基線校正后的曲線Fig.3 Stripping voltammograms of the biosensor in 0.1 mol/L KCl,inset is corresponding calibration curve

圖4 傳感器在500 ng/mL甲基對硫磷溶液中吸附后的溶出伏安圖(a:裸金電極；b:ZrO2/Au電極)Fig.4 Stripping voltammograms of the biosensor after adsorption in 500 ng/mL parathion-methyl(a:bare gold electrode；b:ZrO2/Au)

2.3 實驗條件的選擇

2.3.1 緩沖溶液pH值的選擇

實驗用1.0 mol/L的NaOH和HCl對待測有機(jī)磷溶液的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，考察了溶液pH值對響應(yīng)信號的影響。在其它條件相同的前提下，不同pH值對溶出峰電流的影響如圖5所示。結(jié)果表明，在pH7.0的0.1 mol/L KCl溶液中，傳感器的SWV響應(yīng)電流較大。故實驗中選擇pH值為7.0的0.1 mol/L KCl溶液為支持電解質(zhì)。

圖5 溶液pH值對傳感器響應(yīng)性能的影響（甲基對硫磷濃度：500 ng/mL；掃描電壓：-0.4～0.3 V；頻率25 Hz；電位增量4 mV）Fig.5 Effect of pH of adsorption medium on the adsorption of parathion-methyl(the concentration of parathionmethyl:500 ng/mL;scanning potential range:-0.4 to 0.3 V;frequency:25 Hz;increasing potential:4 mV）

2.3.2 有機(jī)磷吸附方法及吸附時間的選擇

實驗對比了有機(jī)磷在電極上的吸附方法，通過在電極表面滴加有機(jī)磷溶液和把電極置于有機(jī)磷溶液中攪拌兩種方法吸附有機(jī)磷進(jìn)行對比，結(jié)果表明，把電極浸入有機(jī)磷溶液中慢速攪拌2 min既能獲得較大的SWV響應(yīng)電流，又能使電極保持穩(wěn)定。

2.3.3 電化學(xué)參數(shù)的選擇

進(jìn)行電化學(xué)檢測時，不同方波頻率的傳感器SWV響應(yīng)電流如圖6所示，首先，隨著方波頻率的增大，峰電流變大，當(dāng)方波頻率達(dá)到25 Hz時，SWV響應(yīng)電流最大，之后峰電流隨方波頻率的增加而逐漸變小。不同電位增量的SWV響應(yīng)電流選擇如圖7所示，當(dāng)電位增量為4 mV時，峰電流最大，且此時峰形較好。電位增量增至4 mV以后電流逐漸減小，峰變得不對稱，峰形變差。實驗表明，以方波頻率25 Hz，電位增量為4 mV時的峰電流最大，峰形較好。

圖6 方波頻率對傳感器響應(yīng)性能的影響（甲基對硫磷濃度：500 ng/mL；掃描電壓：-0.4～0.3 V；pH：7.0；電位增量：4 mV）Fig.6 Effect of square wave frequency to the biosensor(the concentration of parathion-methyl:500 ng/mL;scanning potential range:-0.4 to 0.3 V;pH:7.0;increasing potential:4 mV）

圖7 電位增量對傳感器響應(yīng)性能的影響（甲基對硫磷濃度：500 ng/mL；掃描電壓：-0.4～0.3 V；pH：7.0；方波頻率：25 Hz）Fig.7 Effect of increasing potential to the biosensor(the concentration of parathion-methyl:500 ng/mL;scanning potential range:-0.4 to 0.3 V;pH:7.0;square wave frequency:25 Hz）

2.4 傳感器的工作曲線

圖8是傳感器在上述所選擇的最佳工作條件下吸附不同濃度甲基對硫磷后所做得的SWV圖，由圖8可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著吸附有機(jī)磷濃度的增大，SWV溶出峰電流也相應(yīng)增大。以甲基對硫磷濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的方波溶出伏安法峰電流為縱坐標(biāo)做圖，得傳感器工作曲線如圖9所示。由圖可知，SWV與甲基對硫磷濃度在10～500 ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，其回歸方程為：y=0.232 3x+1.202,線性相關(guān)系數(shù)r為0.995 3。用同種方法制得的5支ZrO2/Au電極測定10份相同農(nóng)藥樣品（200 ng/mL），測得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.2%。以3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差相對應(yīng)的濃度稱為檢出限，計算得該甲基對硫磷傳感器的檢出限為2.0 ng/mL。

圖8 不同濃度甲基對硫磷的溶出伏安圖（掃描電壓：-0.4～0.3 V；頻率25 Hz；電位增量4 mV）Fig.8 Stripping voltammograms of parathion-methyl concentration(scanning potential range:-0.4 to 0.3 V;frequency:25 Hz;increasing potential:4 mV)

圖9 有機(jī)磷傳感器的工作曲線Fig.9 The calibration curve of parathion-methyl

2.5 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

將制好的甲基對硫磷傳感器在相同條件下對甲基對硫磷溶液（濃度為100 ng/mL）重復(fù)測定10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%；將同批次制備的5支甲基對硫磷傳感器在相同條件下測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%，說明重現(xiàn)性良好。將制備好的有機(jī)磷傳感器浸在pH7.0的磷酸緩沖液中并置于4℃冰箱中保存，測定傳感器放置后對甲基對硫磷的響應(yīng)性能，結(jié)果表明，傳感器放置2周后傳感器對甲基對硫磷的響應(yīng)沒有明顯改變，放置一個月后電極仍能保持原有響應(yīng)的87%。

2.6 傳感器的再生

在與工作曲線相同的電化學(xué)參數(shù)下，將OPs/ZrO2/Au電極進(jìn)行連續(xù)多次SWV掃描，隨著掃描次數(shù)的增加，SWV溶出峰越來越小，在連續(xù)十次掃描后，電極上吸附的OPs幾乎全部被溶出，電極可繼續(xù)用于下次測量。

2.7 非特異性試驗

實驗對傳感器在磷酸根離子、硫酸根離子及硝酸根離子等無機(jī)離子存在下的OPs溶液（100 ng/mL）的電流響應(yīng)進(jìn)行了考察，在這類離子存在下，電流響應(yīng)無明顯變化；實驗還對氯氰菊酯、六六六、三氯殺螨醇等有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥存在時傳感器的電流響應(yīng)進(jìn)行了考察，這類農(nóng)藥殘留對傳感器的電流響應(yīng)也無明顯影響。結(jié)果表明傳感器的特異性較好，可直接用于茶湯中有機(jī)磷農(nóng)殘的檢測。

2.8 初步應(yīng)用

2.8.1 準(zhǔn)確性實驗

為了考察實際應(yīng)用的可能性，用該傳感器檢測了5個不同待測茶葉樣品添加甲基對硫磷溶液后的回收率。先對按2.3所述處理的茶湯樣品進(jìn)行濃度測定，然后在各樣品中加入已知量的甲基對硫磷溶液，再以同樣方法對添加后的樣品進(jìn)行測定，得到的檢測結(jié)果見表1，在5個不同濃度的茶湯樣品中添加甲基對硫磷，得到的平均回收率在94.27%至107.2%之間，表明試驗結(jié)果較為準(zhǔn)確。

表1 添加回收率試驗Tab.1 Detection results of samples of parathion-methyl in tea samples

2.8.2 傳感器工作效率及成本分析

該傳感器直接在金電極上組裝二氧化鋯納米粒子，直接進(jìn)行有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的檢測，傳感器組裝過程所用的無機(jī)材料價格低廉，測定過程簡單。該傳感器的構(gòu)建過程可在1 h內(nèi)完成，每測一個茶葉樣品所用的時間僅需幾分鐘，傳感器的工作效率高。

3 結(jié)論

針對目前茶葉有機(jī)磷分析方法的現(xiàn)狀和不足，提出了一種在金電極面上電沉積二氧化鋯納米粒子以吸附有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的電流型傳感器，以實現(xiàn)對茶湯中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的定量檢測。該傳感器制作成本低廉，操作方便，靈敏度高，是一種簡單快速測定茶葉中有機(jī)磷農(nóng)殘的新方法。

致謝：部分實驗在湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室完成，得到了沈國勵教授、郭慢麗老師等人的熱情相助，在此深表謝意

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