李穎暢,呂春茂,孟憲軍,馬 勇,馮彥博
(1.渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院,遼寧 錦州 121000;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110161)
圣云藍(lán)莓果中錦葵色素-3-半乳糖苷的結(jié)構(gòu)鑒定
李穎暢1,呂春茂2,孟憲軍2,馬 勇1,馮彥博1
(1.渤海大學(xué)生物與食品科學(xué)學(xué)院,遼寧 錦州 121000;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110161)
采用體積分?jǐn)?shù)60%(pH3.0)的乙醇在恒溫水浴(40℃)條件下提取圣云藍(lán)莓花色苷,將所得濃縮液經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化,40℃減壓濃縮,真空干燥得到紫黑色粉末,再經(jīng)過(guò)制備型高效液相色譜分離獲得單體化合物。經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、1H和13C核磁共振、薄層色譜對(duì)單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,確定此化合物為錦葵色素-3-半乳糖苷。
圣云藍(lán)莓果;結(jié)構(gòu)鑒定;錦葵色素-3-半乳糖苷
藍(lán)莓屬于杜鵑花科(Ericaceae) 越橘屬(Vaccinium. SPP)多年生落葉或常綠灌木[1]。圣云藍(lán)莓屬于半高叢品種,果實(shí)扁圓形,呈藍(lán)色,過(guò)熟時(shí)呈藍(lán)黑色,果粉較少,果肉細(xì)膩,種子極小,果實(shí)可溶性固形物含量12.4%。藍(lán)莓果中含有豐富花色苷類物質(zhì),花色苷對(duì)人體健康有益,具有多種生物活性,如抗氧化及清除自由基作用、抗突變活性、抗癌活性、抗炎及抗病毒效果,具有廣闊的應(yīng)用前景[1-4]?;ㄉ諉误w種類很多,但應(yīng)用在食品中的主要有天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?;ㄉ睾湾\葵色素與葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖各自結(jié)合形成的花色苷,且多為單糖和雙糖苷。人們對(duì)不同植物所含花色苷的種類、結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道較多,其分離鑒定的方法也有許多種,如紙層析法分離花色苷元[5]、花色苷的光譜鑒定法[6]。高效液相色譜-質(zhì)譜( HPLC-MS)在目前花色苷鑒定中應(yīng)用最為廣泛[7],Zhang等[8]利用HPLC-MS聯(lián)用的方法鑒定了荔枝皮中的花色苷,此法克服了HPLC法缺少標(biāo)準(zhǔn)品的缺陷,大大提高了花色苷鑒定的準(zhǔn)確性。有關(guān)圣云藍(lán)莓花色苷單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道,為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用圣云藍(lán)莓,本實(shí)驗(yàn)對(duì)圣云藍(lán)莓的主要花色苷單體進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)鑒定。
1.1 材料與試劑
圣云藍(lán)莓果由沈陽(yáng)市雙翼果業(yè)生產(chǎn)示范基地提供。
無(wú)水乙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、甲酸、三氯化鋁(均為分析純)、甲醇(色譜純) 迪馬公司;AB-8大孔樹(shù)脂 天津南開(kāi)大學(xué)化工廠;自制超純水。
1.2 儀器與設(shè)備
UV-1600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;PHS-25型酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠;電熱恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司;SHZ-IIIB型循環(huán)水真空泵上海華琦科學(xué)儀器有限公司;玻璃層析柱(1cm×30cm)
上海青浦滬西儀器廠;DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏儀器設(shè)備有限公司; 制備型高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司;紅外光譜儀 日本島津公司;電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;Avatar330型核磁共振儀 美國(guó)Nicolet公司。
1.3 方法
1.3.1 圣云藍(lán)莓樣品的制備
將一定量圣云藍(lán)莓果,破碎,用pH3.0的60%乙醇溶液按1:15(m/V)的比例混合均勻,于40℃下浸提2h后抽濾,收集濾液,40℃減壓濃縮得到紅色黏稠粗提液。經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化,40℃減壓濃縮得到純化的藍(lán)莓花色苷濃縮液,真空干燥得到紫黑色粉末。
1.3.2 圣云藍(lán)莓花色苷單體制備
通過(guò)制備型反相高效液相色譜對(duì)圣云藍(lán)莓樣品分離,流動(dòng)相為30%甲醇水溶液(含2.0%的甲酸),梯度洗脫,流速為10mL/min,制備單體化合物。
1.3.3 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定
1.3.3.1 紫外-可見(jiàn)光譜分析
1)結(jié)合輸電線路停電檢修,對(duì)OPGW光纜接續(xù)盒進(jìn)行開(kāi)盒檢查。檢查光纜接頭盒密封良好,并且無(wú)腐蝕、損壞或變形等異常情況,防止由于引入纜封堵不嚴(yán)或接續(xù)盒安裝不正確造成盒內(nèi)進(jìn)水結(jié)冰導(dǎo)致光纖受力引起斷纖故障。同時(shí),做好進(jìn)站光纜及引下線接地方式的優(yōu)化設(shè)計(jì)和技術(shù)改造[4-5]。
把藍(lán)莓花色苷單體化合物樣品用0.1%鹽酸甲醇溶液溶解,并用0.1%鹽酸甲醇溶液做參比,用UV1600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)從250~700nm掃描,得到藍(lán)莓花色苷的紫外-可見(jiàn)光譜圖。在藍(lán)莓花色苷甲醇溶液中加AlCl3,觀察最大吸收波長(zhǎng)是否發(fā)生位移。
1.3.3.2 紅外光譜分析
取少量藍(lán)莓花色苷單體化合物樣品置于瑪瑙研缽中,再加適量KBr粉末作為載體,研磨后,放入壓片模具中,加壓,3min后取出樣品,放入儀器的樣品槽中,用紅外光譜儀掃描,得到單體化合物的紅外光譜圖。
1.3.3.3 高效液相色譜-質(zhì)譜法
(1)樣品處理
將真空干燥的圣云藍(lán)莓樣品,用含0.1%鹽酸的50%甲醇溶液溶解,配制成質(zhì)量濃度為2.5mg/mL的溶液,用0.45μm的濾膜過(guò)濾,收集濾液。
(2)分析條件
Agilent1100型高效液相色譜儀,紫外檢測(cè)器,波長(zhǎng):520nm;流動(dòng)相:A甲醇,B 2.5%甲酸水溶液;分離柱:C18(4.6mm×150mm,5μm)。流速為1mL/min,溫度30℃,梯度洗脫程序?yàn)椋?~8min,5%~20%A,95%~80%B;8~15min,20%~50%A,80%~50%B;15~20min,50%A,50%B;20~20.01min,50%~5%A,50%~95%B;20.01~25min,5%A,95%B。(3)質(zhì)譜分析
質(zhì)譜條件為毛細(xì)管電流:55nA,電壓:3200V;霧化壓力:2.76×105Pa;離子穩(wěn)定強(qiáng)度100%,N2流速9.0mL/min,掃描范圍為50~1000u。
1.3.3.4 核磁共振分析
分別將樣品用氘代甲醇溶解,采用核磁共振儀作氫譜和碳譜分析,以氘代甲醇為內(nèi)標(biāo)。
1.3.3.5 藍(lán)莓花色苷的糖組成測(cè)定[9]
將純化的圣云藍(lán)莓花色苷單體溶于3mol/L的HCl中,在100℃條件下回流水解4~5h,得到棕色溶液,用正戊醇萃取至水層無(wú)色,將水層濃縮,得到糖的濃縮液,用薄層層析鑒定糖的組成。配制木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度為1mg/mL,配制一定質(zhì)量濃度的花色苷單體水解后的糖溶液,在距活化過(guò)的薄層板下端1.5cm點(diǎn)樣,點(diǎn)間距1.5~2cm。將點(diǎn)好樣品的薄層層析板置于盛有展開(kāi)劑的層析缸中,密封式展開(kāi),展開(kāi)劑距薄層上端1cm時(shí)取出,展開(kāi)劑為氯仿:冰乙酸:水體積比為30:35:5。將展開(kāi)過(guò)的薄層層析板以吹風(fēng)機(jī)吹干,將顯色劑(苯胺-二苯胺-磷酸)均勻噴灑在薄層層析板上,此板在100℃烘烤10min即可顯色,薄層顯色后,將樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較,確定樣品中糖的組成。
圖1 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.1 Ultraviolet-visible spectrum of monomeric compound
2.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜根據(jù)花色苷結(jié)構(gòu)的不同,在可見(jiàn)區(qū)最大吸收峰的位置有很大差異。由圖1可知,圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物在甲醇溶液的特征吸收波長(zhǎng)分別在279、535nm左右;在300~330nm間沒(méi)有吸收峰,說(shuō)明花色苷分子內(nèi)沒(méi)有酰基;向其甲醇溶液中加AlCl3,可見(jiàn)區(qū)的最大吸收峰未向長(zhǎng)波方向移動(dòng),說(shuō)明此花色苷B-環(huán)無(wú)鄰位酚羥基,因此單體化合物不可能是矢車菊色素、牽?;ㄉ鼗蝻w燕草色素。這一表現(xiàn)與錦葵類花色素的特征吸收相一致[10]。由此可初步推斷其成分可能屬于錦葵類化合物。
2.2 紅外光譜圖分析
圖2 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of monomeric compound
由圖2可知,圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的主要吸收峰有 3425.273、2928.325、1637.583、1595.046、1515.056、1460.647、1383.8051、1346.255、1205.691、1111.701、1068.425cm-1。根據(jù)圖2峰的位置和形狀,并結(jié)合參考文獻(xiàn)[10-12]分析確定, 3425.273cm-1是—OH伸縮振動(dòng)吸收峰,2928.325cm-1是甲氧基 C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰,1383.805、1346.255cm-1,可能是甲氧基C-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰, 1637.583cm-1可能是C=O 鍵伸縮振動(dòng)吸收峰,1595.046、1515.056、1460.647cm-1可能是芳烴骨架C=C 鍵伸縮振動(dòng)吸收峰;1205.691cm-1可能是羥基上的C-O伸縮振動(dòng)吸收峰;1111.701、1068.425cm-1可能是C-O-C伸縮振動(dòng)吸收峰。以上這些都是花色苷的特征吸收峰,可見(jiàn)此花色苷單體中有苯環(huán)、羥基、含氧雜環(huán)和甲氧基的特征基團(tuán),這些基團(tuán)也是黃酮類化合物的特征基團(tuán),可見(jiàn)此花色苷單體化合物屬于黃酮類物質(zhì)。
2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜分析
圖3 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 [MS]/[MS2] spectrum of monomeric compound
由圖3可知,圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物的保留時(shí)間為7.5min,峰面積百分比為96.23%。可以看出此物質(zhì)已經(jīng)達(dá)到所需的純度要求。由分子離子峰為492.8(即493)和子離子峰330.8(331)可知,[MS/MS2] m/z 331.0為花色苷脫掉糖殘基后的碎片峰,即錦葵色素配基離子峰,493與331相差162,正好是一個(gè)半乳糖或葡萄糖去掉一個(gè)H2O之后的相對(duì)分子質(zhì)量,確定連接的糖為半乳糖或葡萄糖,因此,此花色苷單體為錦葵色素的半乳糖苷或葡萄糖苷。
2.4 核磁共振譜圖分析
2.5 糖的組成分析
圖4 圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物糖組成薄層色譜圖Fig.4 Thin-layer chromatographic pattern showing the soluble sugar composition of monomeric compound
圖5 錦葵色素-3-半乳糖苷結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Chemical structure of monomeric compound malvidin-3-galactoside
由圖4可知,薄層色譜中從左到右各單糖依次為木糖、葡萄糖、半乳糖、樣品、阿拉伯糖、果糖。通過(guò)樣品和其他單糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可以看出,圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物中主要是半乳糖。
綜合紫外-可見(jiàn)光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振、糖薄層色譜分析,推斷單體化合物的主要成分為錦葵色素-3-半乳糖苷,結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5。
采用制備型高效液相色譜對(duì)大孔樹(shù)脂純化后的圣云藍(lán)莓花色苷進(jìn)行分離,獲得圣云藍(lán)莓花色苷單體化合物。通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜、紅外光譜、高效液相色譜-質(zhì)譜、核磁共振、薄層色譜等方法對(duì)圣云藍(lán)莓花色苷單體進(jìn)行鑒定,確定此圣云藍(lán)莓花色苷單體為錦葵色素-3-半乳糖苷。圣云藍(lán)莓果實(shí)紅色素主要成分的鑒定對(duì)圣云藍(lán)莓的化學(xué)分類及其果實(shí)紅色素在食品工業(yè)中的綜合開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義。
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Structural Identification of Malvidin-3-galactoside from St. Cloud Blueberry Fruits
LI Ying-chang1,LU Chun-mao2,MENG Xian-jun2,MA Yong1,F(xiàn)ENG Yan-bo1
(1.College of Biology and Food Science, Bohai University, Jinzhou 121000, China;2.College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161,China)
The anthocyanins in St. cloud blueberry fruits were extracted with 60% ethanol (pH 3.0) at 40 ℃ and the extract was concentrated, followed by purification with AB-8 macroporous resin and vacuum drying, to obtain a dark purple powder. A monomeric compound was isolated from the powder by preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) and identified as malvidin-3-arabinoside by ultraviolet-visible, infrared, mass and nuclear magnetic resource spectroscopy as well as thin layer chromatography. This indicates that St. cloud blueberry fruits are exploitable for further development.
St. cloud blueberry fruits;structural identification;malvidin-3-galactoside
TS264.4
A
1002-6630(2010)23-0014-04
2010-01-19
沈陽(yáng)市青年人才計(jì)劃項(xiàng)目(1081240-1-02)
李穎暢(1973—),女,副教授,博士,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物功效成分。E-mail:liyingchangsy@126.com